本文關(guān)鍵詞：家蠅幼蟲抗菌肽的粗提取物對(duì)原代FBL-3細(xì)胞作用機(jī)制的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:1.利用家蠅幼蟲抗菌肽的粗提取物,來探究其對(duì)原代FBL-3細(xì)胞增殖周期是否存在影響。原代FBL-3細(xì)胞的獲取是通過構(gòu)建小鼠腫瘤模型來完成的。原代FBL-3細(xì)胞能夠在生物學(xué)性能方面保持最佳狀態(tài),減少對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的干擾。因此提取原代FBL-3細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)具有重要意義,能夠提高實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性。2.研究家蠅幼蟲抗菌肽粗提物是否通過細(xì)胞膜途徑對(duì)原代FBL-3細(xì)胞發(fā)揮抑制作用。當(dāng)家蠅幼蟲抗菌肽作用FBL-3細(xì)胞后,在顯微鏡下可觀察到細(xì)胞碎片,細(xì)胞質(zhì)涌出,通過熒光素與抗菌肽連接來驗(yàn)證家蠅幼蟲抗菌肽在抑殺FBL-3細(xì)胞時(shí)是否存在細(xì)胞膜機(jī)制。3.抗菌肽抗腫瘤實(shí)驗(yàn)多是在細(xì)胞離體條件下進(jìn)行的,抗菌肽在生物體內(nèi)是否也能發(fā)揮作用值得去研究。利用原代FBL-3細(xì)胞成功構(gòu)建了小鼠模型,進(jìn)而為研究家蠅幼蟲抗菌肽的粗提取物在生物體內(nèi)是否發(fā)揮作用提供前提條件。通過腹腔注射給藥進(jìn)行干預(yù),觀察家蠅幼蟲抗菌肽的粗提取物在模型小鼠體內(nèi)的作用效果。方法:活化大腸桿菌并配制成實(shí)驗(yàn)所需濃度的菌液,2號(hào)昆蟲針經(jīng)酒精燈灼燒后伸入裝有菌液的試管內(nèi),利用蘸有菌液的昆蟲針去刺破已飼養(yǎng)好的三齡幼蟲的體壁,進(jìn)行抗菌肽的誘導(dǎo)。繼續(xù)飼養(yǎng)至24 h后,將幼蟲放入提前冷凍半小時(shí)的玻璃研缽內(nèi),加入配制好的溶液進(jìn)行低溫碾磨。將碾磨好的物質(zhì)放入1.5 m L的EP管內(nèi),然后將低溫離心機(jī)的模式設(shè)置為4℃、12000 r/min,進(jìn)行30分鐘的離心,重復(fù)操作2次。之后得到的上清液進(jìn)行固相萃取,便可獲得粗提取的家蠅幼蟲抗菌肽。對(duì)健康的C57BL/6小鼠進(jìn)行挑選:雄性、體重在(20±1)g左右,構(gòu)建小鼠腫瘤模型。待FBL-3細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)增生期后,利用胰酶充分消化,終止后放入離心管內(nèi)并用移液槍進(jìn)行吹打,調(diào)整濃度制成實(shí)驗(yàn)所需的懸液。經(jīng)右腋皮下注射到小鼠體內(nèi),約一周后可在小鼠右腋下方觸摸到腫瘤團(tuán)塊,剝離瘤塊提取原代FBL-3細(xì)胞,常規(guī)培養(yǎng)。利用CCK-8、MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)家蠅幼蟲抗菌肽的粗提取物對(duì)FBL-3細(xì)胞毒力的大小,通過臺(tái)盼藍(lán)拒染的實(shí)驗(yàn)方法計(jì)算FBL-3存活率的高低。家蠅幼蟲抗菌肽粗提物作用于原代FBL-3細(xì)胞,調(diào)整其作用濃度并使之形成濃度梯度,通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算得知原代FBL-3細(xì)胞在其不同濃度作用時(shí)的細(xì)胞毒力和存活率的大小。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)獲得的所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。利用流式細(xì)胞儀對(duì)經(jīng)過家蠅幼蟲抗菌肽的粗提取物作用后的原代FBL-3的細(xì)胞增殖周期的分布情況進(jìn)行檢測(cè)。將熒光素與家蠅幼蟲抗菌肽進(jìn)行連接并作用于原代FBL-3細(xì)胞,通過激光共聚焦顯微鏡觀察,證明是否存在細(xì)胞膜機(jī)制。將家蠅幼蟲抗菌肽經(jīng)腹腔注射到構(gòu)建模型成功的小鼠體內(nèi),根據(jù)注射劑量分為低劑量、中劑量、高劑量組,同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組與陽性對(duì)照組,進(jìn)行為期一周的干預(yù)。每天觀察并記錄小鼠的生存狀況以及腫瘤的生長大小,一周干預(yù)結(jié)束后對(duì)小鼠頸椎脫臼進(jìn)行處死,剝離腫瘤團(tuán)塊并進(jìn)行稱重,比較重量的大小并計(jì)算抑瘤率。結(jié)果:小鼠腫瘤模型的成功構(gòu)建,為獲取實(shí)驗(yàn)所需的原代FBL-3細(xì)胞提供了前提條件。原代FBL-3細(xì)胞具有最佳的生物學(xué)性能,得到的原代細(xì)胞能夠快速增殖并能傳代生長,為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供了便利。原代細(xì)胞的成功獲取,降低了FBL-3隨傳代次數(shù)增多導(dǎo)致的細(xì)胞活性不佳對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)正確性的干擾,提高了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可利用性。CCK-8、MTT毒性試驗(yàn)和臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)獲得的細(xì)胞毒力及存活率確定了抗菌肽對(duì)原代FBL-3發(fā)揮作用的最佳濃度為300μg/m L。同時(shí)證明抗菌肽的作用強(qiáng)度存在濃度閾值的現(xiàn)象。當(dāng)家蠅幼蟲抗菌肽達(dá)到300μg/m L的濃度時(shí),對(duì)FBL-3細(xì)胞的相對(duì)抑制率達(dá)到了最大為55.60%,當(dāng)?shù)陀?00μg/m L的濃度時(shí),抗菌肽發(fā)揮的強(qiáng)度隨作用濃度的增大而增強(qiáng);當(dāng)高于300μg/m L的濃度時(shí),抗菌肽發(fā)揮的強(qiáng)度隨作用濃度的增大而減弱。細(xì)胞周期的檢測(cè)結(jié)果為:原代FBL-3細(xì)胞經(jīng)家蠅幼蟲抗菌肽的粗提取物作用之后,其增殖周期發(fā)生了不可逆的變化,處在G0/G1期的細(xì)胞比例出現(xiàn)上升,處在S期的細(xì)胞比例出現(xiàn)了下降。當(dāng)恒定家蠅幼蟲抗菌肽的濃度不變時(shí),其對(duì)FBL-3的細(xì)胞增殖周期的作用效果是隨著作用時(shí)間延長而增強(qiáng)的;當(dāng)恒定家蠅幼蟲抗菌肽的作用時(shí)間時(shí),其作用效果是隨著濃度的提升而增強(qiáng)的。說明家蠅幼蟲抗菌肽的粗提取物對(duì)細(xì)胞周期的作用存在劑量-時(shí)間依賴的特性。FBL-3細(xì)胞經(jīng)家蠅幼蟲抗菌肽作用之后于顯微鏡下觀察,鏡下發(fā)現(xiàn)細(xì)胞破碎并成片漂浮,細(xì)胞膜出現(xiàn)孔洞導(dǎo)致內(nèi)容物發(fā)生外涌。在激光共聚焦顯微鏡下可觀察到,連接熒光素的抗菌肽侵入到了細(xì)胞內(nèi)部,細(xì)胞發(fā)出熒光綠,說明抗菌肽破壞細(xì)胞膜使之出現(xiàn)了孔洞,以此進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部。將粗提取獲得的家蠅抗菌肽經(jīng)腹腔注射的方式注入到模型小鼠體內(nèi)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抗菌肽低、中、高劑量組在小鼠體內(nèi)對(duì)FBL-3細(xì)胞形成的腫瘤都具有一定的抑制作用,抑制作用的強(qiáng)度隨著抗菌肽劑量的增大而增強(qiáng),是一種劑量-效應(yīng)關(guān)系,抑制率分別為36.25%、42.38%、48.64%。經(jīng)家蠅幼蟲抗菌肽干預(yù)的模型小鼠,生存狀態(tài)較陰性對(duì)照組小鼠得到了明顯的改觀。結(jié)論:1.家蠅幼蟲抗菌肽的粗提取物對(duì)原代FBL-3細(xì)胞發(fā)揮作用時(shí)存在細(xì)胞周期機(jī)制,它能夠阻滯細(xì)胞增殖周期進(jìn)而使得FBL-3發(fā)生死亡。原代FBL-3的增殖周期發(fā)生了不可逆的變化,細(xì)胞處在G0/G1期的比例出現(xiàn)了升高,處在S期的比例出現(xiàn)了降低。2.家蠅幼蟲抗菌肽粗提物能夠通過作用于細(xì)胞膜使其產(chǎn)生孔洞從而抑殺原代FBL-3細(xì)胞,其作用強(qiáng)度存在濃度閾值的現(xiàn)象。家蠅幼蟲抗菌肽粗提取物的濃度達(dá)到300μg/m L時(shí),它能夠發(fā)揮最強(qiáng)的作用效果。3.家蠅幼蟲抗菌肽粗提物在模型小鼠體內(nèi)能夠明顯地抑制腫瘤的生長,具有可觀的抑瘤率,并能明顯改善模型小鼠的生長狀態(tài)。
【關(guān)鍵詞】：家蠅幼蟲抗菌肽粗提取物 原代FBL-3細(xì)胞 細(xì)胞周期 細(xì)胞膜機(jī)制 荷瘤小鼠
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R384.2
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-15
• 第一部分 家蠅幼蟲抗菌肽粗提物對(duì)原代FBL-3 細(xì)胞增殖周期的影響15-26
• 1 材料與方法15-19
• 1.1 材料15-16
• 1.2 方法16-19
• 2 結(jié)果19-23
• 2.1 模型小鼠腫瘤生長情況19
• 2.2 原代FBL-3 細(xì)胞的生長情況19
• 2.3 家蠅幼蟲抗菌肽的粗提取物影響原代FBL-3 細(xì)胞的增殖周期19-23
• 3 討論23-25
• 4 結(jié)論25-26
• 第二部分 家蠅幼蟲抗菌肽粗提物對(duì)原代FBL-3 細(xì)胞膜作用的研究26-35
• 1 材料與方法26-30
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料26-27
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法27-30
• 2 結(jié)果30-32
• 2.1 CCK-8 細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果30
• 2.2 細(xì)胞生存率結(jié)果30-31
• 2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果31-32
• 3 討論32-34
• 4 結(jié)論34-35
• 第三部分 家蠅幼蟲抗菌肽粗體物對(duì)荷瘤小鼠作用的實(shí)驗(yàn)研究35-43
• 1 材料與方法35-38
• 1.1 材料35-36
• 1.2 方法36-38
• 2 結(jié)果38-40
• 2.1 小鼠模型構(gòu)建結(jié)果38
• 2.2 MTT試驗(yàn)結(jié)果38-39
• 2.3 不同干預(yù)后腫瘤生長情況及小鼠存活狀況39-40
• 3 討論40-42
• 4 結(jié)論42-43
• 參考文獻(xiàn)43-47
• 綜述47-59
• 參考文獻(xiàn)56-59
• 致謝59-61
• 在學(xué)期間承擔(dān)/參與的科研課題與研究成果61-62
• 個(gè)人簡歷62

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中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 聶守民;家蠅幼蟲抗菌肽的粗提取物對(duì)原代FBL-3細(xì)胞作用機(jī)制的研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2016年

  本文關(guān)鍵詞：家蠅幼蟲抗菌肽的粗提取物對(duì)原代FBL-3細(xì)胞作用機(jī)制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：359485