結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種傳染性疾病,以肺結(jié)核最為常見(jiàn)。近年來(lái),多耐藥和廣泛耐藥結(jié)核菌的出現(xiàn)已經(jīng)加劇了結(jié)核病的流行。這與結(jié)核分枝桿菌獨(dú)特的細(xì)胞壁組成可能有直接的關(guān)系,結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁中含有豐富的脂類,主要成分是分枝菌酸。在進(jìn)行潛伏感染時(shí),結(jié)核分枝桿菌主要是進(jìn)行脂質(zhì)代謝而非碳水化合物代謝。為了能在胞內(nèi)生存,結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞后,積累的脂質(zhì)會(huì)以三酰甘油（TAG）的形式儲(chǔ)存,為生長(zhǎng)提供能源。在結(jié)核分枝桿菌的基因組中,有大約250個(gè)基因參與脂類代謝,這250個(gè)基因可以分為5個(gè)家族:Lip家族、磷脂酶家族、PE/PPE家族、β-內(nèi)酰胺家族和角質(zhì)酶家族。本文主要圍繞結(jié)核分枝桿菌Lip家族成員—LipW（Rv0217c）進(jìn)行相關(guān)功能研究。本課題主要研究結(jié)核分枝桿菌Lip家族成員之一—LipW（Rv0217c）,探究LipW蛋白在結(jié)核分枝桿菌中的生物學(xué)作用;LipW的缺失菌株抵抗脅迫環(huán)境（SDS、酸和H₂O₂等）的能力;LipW是否會(huì)對(duì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng),可否作為新型的結(jié)核保護(hù)疫苗。利用以下試驗(yàn)方法去探究LipW蛋白的性質(zhì),（1）通過(guò)NCBI... 

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017年全球結(jié)核病發(fā)病率[3]

) 99 73 67 70 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是指多肽鏈主鏈原子的局部空間分布，肽鏈中的主，氫鍵主要有 α-螺旋、β-折疊和 β-轉(zhuǎn)角等。我們通過(guò)對(duì) LipW 的析發(fā)現(xiàn)（圖 4-1），LipW 蛋白質(zhì)含有 9 個(gè) α-螺旋和 8個(gè) β-折疊，酸-天冬氨酸-組氨酸，位于 LipW 氨基酸序列的第 149 位、239 個(gè)氨基酸序列分別具有親核載體、質(zhì)子載體和形成依懶性電子網(wǎng)17c 基因體外擴(kuò)增與 pET-28a-Rv0217c 陽(yáng)性鑒定我們進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，以結(jié)核分枝桿菌 H37Rv 為模板，將 PCR 產(chǎn)糖凝膠電泳顯示（圖 4-2a），其 PCR 產(chǎn)物大小為 909 bp，與我物片段大小一致，然后將 pET-28a-Rv0217c 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸α 中，挑取單菌落，通過(guò)菌液 PCR 驗(yàn)證陽(yáng)性后(圖 4-2b)，將提取然后送北京華大公司測(cè)序鑒定。

我們從包涵體中純化、復(fù)性得到 LipW 蛋白。SDS-PAGE 凝膠電泳結(jié)果顯示 LipW 純化成功（圖4-3b）。圖 4-3 （a）通過(guò) SDS-PAGE分析 LipW 在大腸桿菌中的表達(dá), (b) His-tag 蛋白純化。Figure 4-3. The expression (a) and purification (b) of His-tagged Rv0217c recombinant protein inEscherichia coli by SDS-PAGE at 37℃. (a) Lane1: protein marker; lane2: uninduced culture pellet; lane3:induced (with IPTG) culture lysis; lane4: induced (with IPTG) culture pellet; lane5: induced (with IPTG) culturesupernatant. (b) Lane1: protein marker; lane 2-5: purified Rv0217c protein.4.5 LipW 蛋白活性測(cè)定我們采用對(duì)硝基苯酚作為標(biāo)準(zhǔn)試劑，繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖 4-4b ）。將透析的蛋白進(jìn)行蛋白定量，并且配制底物溶液，在本次實(shí)驗(yàn)中我們利用的 TIANGEN的 Bradford protein assay kit 做蛋白定量（圖 4-4a），用 BSA做空白對(duì)照，最后測(cè)定 595 nm 處的吸光值。根據(jù)蛋白的濃度知道 LipW 的比活：55.3 U/mg。38 kDa

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室耐藥診斷技術(shù)進(jìn)展[J]. 劉君,裴豪,蒯守剛,尚忠波.  現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué). 2014(20)
[2]結(jié)核分枝桿菌酯酶Rv1400c原核表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的酶活性分析[J]. 陶榮珊,李金偉,劉思國(guó),王全凱.  吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2014(06)



本文編號(hào)：3589126