背景在真核生物細(xì)胞中,溶酶體是細(xì)胞內(nèi)基本的消化器官,其腔內(nèi)維持酸性環(huán)境,PH約為5,內(nèi)含50多種水解酶來(lái)降解吞噬進(jìn)來(lái)的物質(zhì)。據(jù)報(bào)道,溶酶體酸化機(jī)制失調(diào)是許多溶酶體貯積�。↙SDs）、退行性疾病的發(fā)病機(jī)理。溶酶體酸性機(jī)制由V-ATPase復(fù)合體調(diào)節(jié),質(zhì)子泵由ATP驅(qū)動(dòng),存在于真核生物的胞內(nèi)和細(xì)胞膜上,主要負(fù)責(zé)建立和維持細(xì)胞內(nèi)的酸性PH,并以ATP依賴的方式將H^﹢注入細(xì)胞腔內(nèi)。V-ATPase是溶酶體膜上的可逆組裝V1/V0質(zhì)子泵,是一個(gè)多亞基復(fù)合體,包括位于細(xì)胞質(zhì)的V1復(fù)合體和錨定于溶酶體膜上的V0復(fù)合體。V1包括至少八個(gè)不同的亞基（A-H）,ATP水解的三個(gè)催化位點(diǎn)由A和B亞基組成,V0區(qū)包含亞基a、c、c’、c"、d和e,負(fù)責(zé)質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。ATP6V1A基因編碼V-ATPase質(zhì)子泵的一個(gè)組成成分,即定位于質(zhì)子泵上V1區(qū)的A亞基。前期實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)HSF4通過(guò)維持溶酶體酸性PH,上調(diào)溶酶體活性。HSF4調(diào)控晶狀體上皮細(xì)胞中小熱休克蛋白（比如,HSP25和CRYAB）的表達(dá)。HSP 25和alpha B-crystallin作為分子伴侶,在蛋白質(zhì)質(zhì)量控制的各個(gè)方... 

【文章來(lái)源】：河南大學(xué)河南省

【文章頁(yè)數(shù)】：72 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

在晶狀體上皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)HSF4b，ATP6V1A的蛋白水平明顯升高，RNA水平無(wú)明顯變化，蛋白的穩(wěn)定性增強(qiáng)

2.3 Alpha B-crystallin 缺失促進(jìn) ATP6V1A 的泛素化，促其通過(guò)泛素蛋白酶體途徑降解。（/Hsf4b-/-、mlec/HA-Hsf4b、mlec/HA-Hsf4b/sh-cryαB 三種細(xì)胞分別計(jì)數(shù)，鋪于 6 cm 皿中，8×12～24 h后，全部用50μg/ml的CHX處理的同時(shí)，分別用20 μm/ml CQ和10 μm/ml MG13lec/HA-Hsf4b/sh-cryαB 各一皿，6h 后，SDS Lysis Buffer 裂解細(xì)胞，再對(duì)相關(guān)蛋白進(jìn)行 Wes。β-actin 為內(nèi)參。（B）將 mlec/HA-Hsf4b/sh-cryαB 計(jì)數(shù)，鋪于兩個(gè) 10 cm 皿，2.2×106/～24 h 后，將其中一皿用 10 μm/ml MG132 處理 8 h，NP40 Lysis Buffer 裂解細(xì)胞后，用免TP6V1A，Western blot 檢測(cè) Ubiquitin。Input 為陽(yáng)性對(duì)照。（C）mlec/HA-Hsf4-Hsf4b/sh-cryαB 計(jì)數(shù)后，分別鋪與 6 cm 皿，8×105/皿，培養(yǎng) 12～24 h 后，各取一皿用 10 um 處理 8 h 后，用 Ubiquitin beads 拉 ATP6V1A。Input 為陽(yáng)性對(duì)照。

TP6V1A 與 alpha B-crystallin 共分布在溶酶體上。（A）用溶酶體富集試劑盒法分離 mlec/Hsf4b-/-和 mlec/HA-Hsf4b 中的溶酶體，再對(duì)相關(guān)蛋白進(jìn)行 Wes作為溶酶體標(biāo)記物，beat-actin 作為細(xì)胞總裂解液標(biāo)記物。（B）將 mlec/HA-個(gè)于 chamber 中，培養(yǎng) 12～24 h，將細(xì)胞固定后做免疫熒光。ATP6V1A 染紅lin 染綠色 488，藍(lán)色 DAPI 染核。lpha B-crystallin 只與 ATP6V1A 亞基相互作用確定 alpha B-crystallin 與 ATP6V1A 發(fā)生相互作用，只不過(guò) V-AT合體，V1 就由 8 個(gè)亞基(a-h)組成，負(fù)責(zé) ATP 水解。V1 結(jié)構(gòu)域的 結(jié)構(gòu)域旋轉(zhuǎn)一周提供了所需能量，推動(dòng) 2-4 個(gè)位于胞質(zhì) H+穿過(guò)膜的影響[10]。V-ATPase 質(zhì)子泵是多亞基協(xié)同維護(hù)溶酶體內(nèi)的酸性ha B-crystallin 與 ATP6V1A 發(fā)生相互作用的同時(shí)，也想知道 V-AT是否與 alpha B-crystallin 相互作用。我們運(yùn)用 GST Pull down 檢 V-ATPase 質(zhì)子泵的其他亞基的相互作用，Western blot 結(jié)果顯示，G

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Huntingtin Cleavage Induced by Thrombin In Vitro[J]. Fang LIN;Junchao WU;Yan WANG;and Zhenghong QIN Department of Pharmacology,Laboratory of Aging and Nervous Diseases,Soochow University School of Medicine,Suzhou 215123,China.  Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 2007(01)



本文編號(hào)：3588071