目的構(gòu)建鼠源真核表達(dá)載體pEGFP-C1-跨膜蛋白88質(zhì)粒（pEGFP-C1-TMEM88）,并觀察其對RAW264.7細(xì)胞中炎癥因子分泌的影響和對RAW264.7細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法在小鼠正常肝細(xì)胞株（AML-12）中提取RNA并且逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,同時將引物稀釋到10μmol/L,其余作為儲備液。采用PCR技術(shù)擴(kuò)增跨膜蛋白88（TMEM88）并鑒定,使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物的純化回收。再對PCR產(chǎn)物及載體進(jìn)行酶切回收,酶切片段連接后,進(jìn)行連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化、挑菌、搖菌、質(zhì)粒抽提。酶切鑒定后,送至測序鑒定。將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至小鼠單核巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞中,通過MTT實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測其對細(xì)胞增殖和凋亡的影響,并用ELISA技術(shù)檢測炎癥因子:白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在RAW264.7細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果測序結(jié)果顯示pEGFP-C1-TMEM88真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功;MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:48 h后過表達(dá)TMEM88組細(xì)胞的增殖率為（0.71±0.04）,顯著低于對照組（0.94±0.06）（F=21.55,P&l... 

【文章來源】：安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2019,54(12)北大核心

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重組質(zhì)粒 pEGFP-C1-TMEM88 的酶切鑒定

將pEGFP-C1-TMEM88表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞中,利用Western blot檢測其蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示,過表達(dá)質(zhì)粒組的TMEM88的蛋白表達(dá)量明顯高于Control組(F=134.64,P<0.01);當(dāng)用TMEM88抗體免疫印跡時,過表達(dá)TMEM88組分別在約17 ku(內(nèi)源性TMEM88)和44 ku(GFP-TMEM88過表達(dá),即27 ku + 17 ku)顯現(xiàn)蛋白印跡,而Control組僅在約17 ku(內(nèi)源性TMEM88)的顯現(xiàn)蛋白印跡,表明pEGFP-C1-TMEM88能夠成功表達(dá),見圖2。2.3 TMEM88對RAW264.7細(xì)胞增殖的影響

將生長對數(shù)期的RAW.264.7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-TMEM88質(zhì)粒,48 h后用凋亡試劑盒在流式儀上檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示,N組的細(xì)胞凋亡率為(6.72±0.92)%,Control組的細(xì)胞凋亡率為(7.78±1.67)%,過表達(dá)TMEM88組的細(xì)胞凋亡率為(11.52±1.43)%,顯著高于Control組 (F=10.07, P<0.05),結(jié)果顯示,過表達(dá)TMEM88后,能夠促進(jìn)RAW.264.7細(xì)胞的凋亡,見圖4A、4B。2.5 TMEM88在RAW264.7細(xì)胞中對炎癥因子分泌的影響

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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