本文關(guān)鍵詞：精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶PRMT7對干性轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控及對胚胎干細胞干性維持的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶PRMT7是PRMT(Protein Arginine Methyltransf erases)家族的一員,其家族成員能夠?qū)-腺苷甲硫氨酸上的甲基化基團轉(zhuǎn)移到底物蛋白的精氨酸位點上。該修飾對于生命體非常重要,不但這些催化酶廣泛存在,都有很多甲基化底物,也同時存在很多結(jié)構(gòu)域識別這一修飾。廣泛的存在意味著功能的復(fù)雜和多樣,PRMT參與包括RNA形成、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等諸多過程。像PRMT1、PRMT4、PRMT5、PRMT6它們的催化底物及相應(yīng)的功能是被大家研究比較多的,而關(guān)于另外幾個成員的報道較少。我們之所以選擇研究PRMT7,一方面關(guān)于PRMT7的研究較少,是新被發(fā)現(xiàn)的蛋白。另一方面是有PRMT7在胚胎干細胞中高表達的報道,但沒有進一步對這種現(xiàn)象的原因、意義深層挖掘。胚胎干細胞(ESC)是從胚胎發(fā)育的囊胚期內(nèi)細胞團中分離出的一類細胞,具有很強的干性,即自我更新和分化成各類成體細胞的能力。胚胎干細胞的干性維持是復(fù)雜調(diào)控的結(jié)果,其中以SOX2、OCT4、C-MYC及KLF4為代表的這類轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控大量下游靶基因的轉(zhuǎn)錄開啟或關(guān)閉,對干性維持起到至關(guān)重要的作用。這也意味著它們自身的蛋白水平及轉(zhuǎn)錄活性需要得到精確的控制。所以在后期尋找PRMT7影響干細胞干性維持的機制時優(yōu)先從這些調(diào)控因子入手。我們首先檢測了不同細胞系中內(nèi)源PRMT7的表達情況,發(fā)現(xiàn)它確實在胚胎干細胞中高表達。然后將ES細胞誘導(dǎo)分化,看到其表達水平也隨之有所降低。為了檢驗PRMT7對于干性維持的影響,我們利用其siRNA進行內(nèi)源敲除實驗,發(fā)現(xiàn)ES細胞分化程度增加,說明它對于胚胎干細胞干性維持來說是有影響的。接下來我們檢測了PRMT7對干性因子包括OCT4等的表達水平、轉(zhuǎn)錄活性、翻譯后修飾的影響,以揭開PRMT7發(fā)揮作用的機制,發(fā)現(xiàn)PRMT7與干性因子之間存在相互作用,尤其是與OCT4在體內(nèi)外反應(yīng)中都有結(jié)合。熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示PRMT7可轉(zhuǎn)錄激活OCT4,對SOX2和KLF4轉(zhuǎn)錄活性卻沒有影響,說明此調(diào)節(jié)具有特異性。最后純化了GST-PRMT7,進行體外甲基化實驗,雖然沒有看到它甲基化干性因子的信號,但此次實驗中發(fā)現(xiàn)PRMT7自身存在甲基化修飾�？傊�,本論文闡示了PRMT7可以調(diào)節(jié)OCT4并介入胚胎干細胞干性維持。
【關(guān)鍵詞】：PRMT7 胚胎干細胞 OCT4 精氨酸甲基化
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R321
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 第一章 文獻綜述11-27
• 1.1 表觀遺傳學(xué)概述11-12
• 1.2 組蛋白修飾12-13
• 1.3 蛋白質(zhì)甲基化修飾13-16
• 1.4 胚胎干細胞16-18
• 1.5 精氨酸甲基化18-24
• 1.6 精氨酸甲基化酶PRMT7研究現(xiàn)狀24-26
• 1.7 總結(jié)26-27
• 第二章 實驗材料27-37
• 2.1 質(zhì)粒信息27
• 2.2 抗體信息27
• 2.3 引物序列信息27-29
• 2.3.1 qRT-PCR引物序列28
• 2.3.2 shRNA和siRNA序列28-29
• 2.4 細胞系及相關(guān)培養(yǎng)基配制29
• 2.5 細菌及培養(yǎng)基配制29-30
• 2.6 DNA瓊脂糖凝膠電泳緩沖液配制30-31
• 2.7 蛋白提取相關(guān)試劑配制31-32
• 2.8 SDS-PAGE凝膠及其電泳緩沖液配制32-34
• 2.9 甲基化反應(yīng)放射自顯影溶液配制34-35
• 2.10 其他實驗試劑35-36
• 2.11 實驗儀器36-37
• 第三章 實驗方法37-49
• 3.1 堿性磷酸酶染色37
• 3.2 免疫染色37-38
• 3.3 免疫共沉淀38-39
• 3.4 蛋白質(zhì)免疫印跡39
• 3.5 RNA抽提、反轉(zhuǎn)及實時熒光定量PCR39-41
• 3.6 原核系統(tǒng)中GST融合蛋白的表達、純化41-42
• 3.7 體外甲基化實驗42-43
• 3.8 細胞實驗43-45
• 3.9 熒光素酶報告系統(tǒng)45
• 3.10 克隆構(gòu)建45-49
• 第四章 實驗結(jié)果49-67
• 4.1 檢測細胞內(nèi)源PRMT7表達49-50
• 4.2 誘導(dǎo)分化實驗50-52
• 4.3 內(nèi)源PRMT7敲除實驗52-55
• 4.3.1 PRMT7敲除對胚胎干細胞的影響52-53
• 4.3.2 PRMT7敲除對干性因子的影響53-55
• 4.4 PRMT7與干性因子之間相互作用檢測55-57
• 4.5 PRMT7對干性因子的調(diào)控作用57-64
• 4.5.1 PRMT7對干性因子轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控57-60
• 4.5.2 PRMT7對干性因子蛋白水平調(diào)控60-64
• 4.6 體外甲基化實驗64-67
• 第五章 總結(jié)與展望67-70
• 參考文獻70-75
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文75-76
• 致謝76

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本文編號：354941