目的:1.構(gòu)建Zmp1慢病毒載體LV2-zmp1,用LV2-zmp1重組慢病毒感染巨噬細胞RAW264.7細胞,使Zmp1基因在巨噬細胞RAW264.7中穩(wěn)定表達。2.慢病毒LV2-zmp1感染巨噬細胞RAW264.7,同時用雷帕霉素誘導(dǎo)自噬和羥氯喹抑制自噬,觀察Zmp1對巨噬細胞RAW264.7自噬的影響。方法:1.以結(jié)核分枝桿菌基因組為模板,經(jīng)PCR法擴增出鋅離子依賴性金屬蛋白酶1（Zmp1）基因,定向克隆至慢病毒表達質(zhì)粒LV1獲得Zmp1重組慢病毒表達質(zhì)粒LV1-zmp1。將慢病毒表達質(zhì)粒LV1-zmp1、重組穿梭質(zhì)粒pGag/Pol、輔助包裝質(zhì)粒pRev、pVSV-G四質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞進行病毒包裝,轉(zhuǎn)染72h后收集病毒液并進行滴度檢測,得到滴度為1x10⁸TU/ml的LV2-zmp1重組慢病毒。用LV2-zmp1重組慢病毒感染RAW264.7細胞,感染96h后采用熒光顯微鏡觀察GFP表達反映病毒的感染情況;提取RAW264.7細胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,經(jīng)RT-PCR檢測Zmp1基因在RAW264.7細胞中的表達情況;提取RAW264.7細胞總蛋... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

重組質(zhì)粒LV1-zmp1中Zmp1基因的部分測序鑒定結(jié)果

2.3 重組慢病毒 LV2-zmp1 的滴度檢測在熒光顯微鏡下，結(jié)合稀釋倍數(shù)，計算出各劑量組帶熒光細胞的比例，得出LV2-zmp1 重組慢病毒原液滴度為 1x108TU/ml（圖 1-3）。圖 1-2 重組質(zhì)粒 LV1-zmp1 中 Zmp1 基因的部分測序鑒定結(jié)果Fig.1-2 Partial sequence result of Zmp1 gene in the recombinant plasmid LV1-zmp1

31W264.7 細胞中 Zmp1 mRNA 表達水平 感染 RAW264.7 細胞 72 h 后，以β-Actin 作為內(nèi)參，RT-中 Zmp1 mRNA 表達水平。慢病毒 LV2-zmp1 感染的細產(chǎn)物的表達水平很高。對照 LV-NC 的細胞和空白對照 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達水平均相對較低，差異具有統(tǒng)計學(xué)）。熒光顯微鏡觀察 LV2-zmp1 感染目的細胞 RAW264.7W264.7 infected with LV2-zmp1 by inverted fluorescence microscope（100×）

【參考文獻】：
期刊論文
[1]結(jié)核分枝桿菌分泌性酸性磷酸酶（SapM）抑制小鼠巨噬細胞自噬[J]. 胡東,王婉,趙潤鵬,徐雪維,邢應(yīng)如,徐從景,張榮波,吳靜.  細胞與分子免疫學(xué)雜志. 2016(06)
[2]鋅依賴的金屬蛋白酶1促進巨噬細胞凋亡[J]. 李鵬,何永林,張繼明,方陳城.  細胞與分子免疫學(xué)雜志. 2015(12)



本文編號：3512994