KCTD1（potassium channel tetramerization domain containing 1）屬于鉀離子通道四聚化結(jié)構(gòu)域蛋白基因家族的成員,該家族成員的N端具有保守的BTB（Bric-a-brack, Tram-track, Broad complex）結(jié)構(gòu)域和一個(gè)鉀離子四聚體通道結(jié)構(gòu)域（K-ketra）,但C端是多變的。人類KCTD基因家族成員的突變和表達(dá)異常與多種疾病相關(guān)。研究選取人類皮膚-耳朵-乳頭綜合征（Scalp-Ear-Nipple Syndrome,SEN）致病基因KCTD1在斑馬魚（Danio rerio）中的直系同源基因kctd1,利用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行基因敲除,通過F₁剪尾檢測和F₁內(nèi)交,成功獲得kctd1 F₂純合突變體。獲得的突變體類型為+7 bp和-8 bp。研究結(jié)果對(duì)于人類KCTD1基因功能以及KCTD1致病機(jī)理的研究具有參考價(jià)值。 

【文章來源】：生物學(xué)雜志. 2019,36(05)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

靶點(diǎn)設(shè)計(jì)示意圖注:紅色堿基代表

?舛?量檢測，使用2－ΔΔct法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，使用軟件Graphpadprism5繪制柱狀圖。表2qＲT-PCＲ引物序列Table2PrimersequencesforqＲT-PCＲ基因名稱Genename引物序列(5'－3')Primersequence退火溫度Annealingtemperature片段大小Productsize參考文獻(xiàn)Ｒeferenceβ-actin(F)CGAGCTGTCTTCCCATCCA(Ｒ)TCACCAACGTAGCTGTCTTTCTG60℃86bp［25］kctd1(F)ACGCTGAGTGGAGATAAAGCC(Ｒ)GTACCCGTTCAGAGGGAAGC60℃129bp—紅框代表PAM和靶序列，黑色箭頭代表Cas9切割位置圖2kctd1注射敲除后T7E1酶切檢測和測序分析Figure2T7E1assayandsequencinganalysisofkctd1knock-outafterinjection2結(jié)果與分析2.1F0顯微注射敲除檢測經(jīng)過T7E1酶切檢測，根據(jù)公式100×{1－sqrt［1－(b+c)/(a+b+c)］}計(jì)算敲除效率，a為未切開條帶灰度值，b、c為切開條帶的灰度值［26］。得出kctd1顯微注射的敲除效率范圍是11.60%～37.41%，將酶切成功對(duì)應(yīng)的PCＲ產(chǎn)物進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)在靶點(diǎn)附近及以后出現(xiàn)亂峰，說明敲除成功(圖2)。2.2F1突變類型檢測通過F1成魚剪尾及PCＲ產(chǎn)物TA克隆檢測，成功獲得kctd1兩種突變類型，為+7bp和－8bp(圖3)。2.3F2純合突變體的篩選經(jīng)過序列比對(duì)，得到F2兩種突變類型的純合突變體－8bp－/－18尾，+7bp－/－11尾，F(xiàn)2具體基因型統(tǒng)計(jì)情況如表3所示。紅框代表靶序列，紅色箭頭代表Cas9切割位置圖3F1突變類型檢測Figure3GenotypeidentificationofF19第36卷第5期2019?

6］。得出kctd1顯微注射的敲除效率范圍是11.60%～37.41%，將酶切成功對(duì)應(yīng)的PCＲ產(chǎn)物進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)在靶點(diǎn)附近及以后出現(xiàn)亂峰，說明敲除成功(圖2)。2.2F1突變類型檢測通過F1成魚剪尾及PCＲ產(chǎn)物TA克隆檢測，成功獲得kctd1兩種突變類型，為+7bp和－8bp(圖3)。2.3F2純合突變體的篩選經(jīng)過序列比對(duì)，得到F2兩種突變類型的純合突變體－8bp－/－18尾，+7bp－/－11尾，F(xiàn)2具體基因型統(tǒng)計(jì)情況如表3所示。紅框代表靶序列，紅色箭頭代表Cas9切割位置圖3F1突變類型檢測Figure3GenotypeidentificationofF19第36卷第5期2019年10月生物學(xué)雜志JOUＲNALOFBIOLOGYVol.36No.5Oct.2019???????????????????????????????????????????????

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3456457