缺氧/缺血性損傷廣泛存在于包括癌癥、中風以及神經(jīng)退行性疾病等多種疾病中,再供氧/再灌注會導(dǎo)致DNA損傷的積累從而加重缺氧/缺血造成的損傷。缺氧/缺血-再供氧/再灌注會導(dǎo)致非正常折疊或受損蛋白的積聚,這些蛋白大多被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)清除。泛素介導(dǎo)的蛋白降解作用由底物蛋白的泛素化以及26S蛋白酶體參與的蛋白降解構(gòu)成。泛素化包括了分別由E1激活酶、E2結(jié)合酶及E3連接酶催化的泛素激活、耦聯(lián)以及轉(zhuǎn)移三個級聯(lián)步驟。其中,E3連接酶決定了泛素化修飾的底物專一性。以cullin環(huán)為基礎(chǔ)的E3是E3酶中最大的家族之一,Cullin4A （CUL4A）是該家族的核心成員之一。CUL4A通過參與p53、p27和Cdt1等相關(guān)蛋白的降解過程,在腫瘤抑制、細胞成活、DNA損傷響應(yīng)、細胞增殖以及基因組穩(wěn)定性的維持等方面發(fā)揮了重要的作用。盡管有證據(jù)暗示表達上調(diào)的Cul4A有可能參與到細胞對缺氧/缺血-再供氧/再灌注導(dǎo)致的損傷的響應(yīng)中,但是CUL4A在這一過程中的具體作用仍不得而知。在本研究中,我們構(gòu)建了人源CUL4A（human CUL4A, hCUL4A）的腺病毒表達載體,通過病毒轉(zhuǎn)染將hCUL4A成功導(dǎo)入了P... 

【文章來源】：中南大學(xué)湖南省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：124 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
英文縮寫注釋
前言
技術(shù)路線
第一章 缺氧-再供氧誘導(dǎo)PC12細胞Cul4A基因表達
    1.1 材料與方法
        1.1.1 材料
        1.1.2 方法
    1.2 結(jié)果
        1.2.1 缺氧系統(tǒng)效果評估
        1.2.2 H/R誘導(dǎo)PC12細胞內(nèi)源性Cul4A mRNA表達
    1.3 討論
        1.3.1 細胞系的選擇
        1.3.2 評估細胞缺氧系統(tǒng)的有效性及穩(wěn)定性
        1.3.3 PC12細胞內(nèi)源性Cul4A基因?qū)/R的響應(yīng)
第二章 人CUL4A重組腺病毒載體的構(gòu)建及其在PC12細胞中的表達特點
    2.1 材料與方法
        2.1.1 材料
        2.1.2 方法
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 穿梭質(zhì)粒pDC315-hCUL4A-EGFP的構(gòu)建
        2.2.2 pDC315-hCUL4A-EGFP質(zhì)粒表達檢測
        2.2.3 腺病毒包裝、純化及滴度測定
        2.2.4 PC12細胞表達hCUL4A-GFP
        2.2.5 hCUL4A-GFP融合蛋白在PC12細胞中的表達特征
    2.3 討論
第三章 過表達人CUL4A對PC12細胞缺氧-再供氧損傷的保護作用及其機制探討
    3.1 材料與方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 方法
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 過表達hCUL4A促進H/R后的PC12細胞存活
        3.2.2 過表達hCUL4A抑制PC12細胞H/R后DNA損傷
        3.2.3 過表達hCUL4A調(diào)節(jié)PC12細胞H/R后細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達
    3.3 討論
        3.3.1 CUL4A對細胞凋亡相關(guān)蛋白的影響
        3.3.2 CUL4A在H/R引起的損傷中的蛋白降解與非蛋白降解功能
第四章 過表達hCUL4A對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用
    4.1 材料與方法
        4.1.1 材料
        4.1.2 方法
    4.2 結(jié)果
        4.2.1 hCUL4A-GFP融合蛋白在大鼠腦中的表達特點
        4.2.2 hCUL4A過表達對I/R導(dǎo)致的腦梗塞體積及腦水腫程度的影響
        4.2.3 hCUL4A過表達對I/R導(dǎo)致的神經(jīng)組織病理改變的影響
        4.2.4 hCUL4A過表達對I/R后大鼠神經(jīng)行為的影響
    4.3 討論
        4.3.1 CUL4A在腦I/R損傷中的作用
        4.3.2 前景與展望
結(jié)論
參考文獻
附錄1 pOTB7-CUL4A質(zhì)粒圖譜
附錄2 pDC315-EGFP質(zhì)粒圖譜
附錄3 pBHG lox ΔE1,3 Cre質(zhì)粒圖譜
綜述 CUL4A與缺氧再供氧、缺血再灌注損傷的研究進展
    參考文獻
致謝
攻讀學(xué)位期間主要的研究成果


【參考文獻】：
期刊論文
[1]大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)、鑒定及氧糖剝奪模型的建立[J]. 魏愛宣,李昕華,閆世軍,何金婷,莽靖,邢影,邵延坤,徐忠信.  中國老年學(xué)雜志. 2010(03)
[2]成年大鼠側(cè)腦室注射與腦實質(zhì)注射腺病毒表達載體轉(zhuǎn)染腦細胞的比較研究[J]. 王薇,郭靈.  廣西醫(yī)學(xué). 2009(02)
[3]泛素-蛋白酶體途徑的組成和功能[J]. 倪曉光,趙平.  生理科學(xué)進展. 2006(03)
[4]灌注固定大鼠的技術(shù)操作及常見問題[J]. 劉海燕.  齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報. 2006(11)



本文編號：3456706