第一部分人FXYD6抗原的表達(dá)與純化目的：構(gòu)建含人FXYD6胞內(nèi)區(qū)-G4S-FXYD6胞外區(qū)-G4S-GST-His6TAG基因序列的原核表達(dá)質(zhì)粒，并誘導(dǎo)其表達(dá)，并對表達(dá)出的蛋白進(jìn)行純化。方法：構(gòu)建去除FXYD6跨膜區(qū)域的FXYD6胞內(nèi)區(qū)-G4S-FXYD6胞外區(qū)-G4S基因片段，插入原核表達(dá)載體pET30a-GST中，以重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)情況，重組蛋白經(jīng)鎳柱純化后，SDS-PAGE檢測蛋白純度，BCA法檢測濃度。結(jié)果：成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET30a-GST-FXYD6，誘導(dǎo)后重組蛋白大小與預(yù)期相符在33kD-45kD之間，其純度在90%以上。結(jié)論：成功制備出了FXYD6重組蛋白，為制備FXYD6胞外區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的單克隆抗體庫奠定了基礎(chǔ)。第二部分人FXYD6單克隆抗體庫的制備與簽定目的：研制抗人FXYD6功能區(qū)單克隆抗體庫，并對其進(jìn)行簽定及篩選分泌胞內(nèi)、胞外區(qū)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。方法：以去除跨膜區(qū)域FXYD6功能區(qū)重組蛋白作為免疫原免疫BALB/c小鼠，取其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)多次篩選及克隆化，建立可穩(wěn)定分泌抗人... 

【文章來源】：蘇州大學(xué)江蘇省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：107 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

FXYD6重組基因片段的獲得

圖 1. FXYD6 重組基因片段的獲得 圖 2. 重組表達(dá)質(zhì)粒 PCR 簽定注：M. DNAmarker 注：M. DNAmarker1. PCR 產(chǎn)物 1. PCR 產(chǎn)物3.2 FXYD6 抗原的表達(dá)表達(dá)菌 BL21 在 37℃經(jīng) 0.5mM IPTG 誘導(dǎo) 4 小時后表達(dá)出目的蛋白經(jīng)DS-PAGE 其相對分子質(zhì)量與預(yù)期相符，較誘導(dǎo)前出現(xiàn)明顯的梭形條帶(如圖 3)。

18圖 3. FXYD6 抗原誘導(dǎo)表達(dá)注：4: 誘導(dǎo)前1. 2. 3. 5: 誘導(dǎo)后M: 蛋白 marker 抗原的純化破碎后，SDS-PAGE 檢測目的蛋白主要集中在上清液 標(biāo)簽，我們選用鎳柱純化目的蛋白，在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)圖 5），較低濃度咪唑就可以將目的蛋白洗脫，確定洗脫目的蛋白，洗脫出的目的蛋白超濾換 PBS 后，右（如圖 5）。應(yīng)用 BCA 蛋白定量方法檢測純化后蛋


本文編號：3444018