目的:探討葛根素（puerarin,PUE）預(yù)處理對(duì)缺氧/復(fù)氧（hypoxia reoxygenation,H/R）損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的保護(hù)作用。方法:HUVECs隨機(jī)分為正常對(duì)照（control）組、H/R組、單純PUE組和PUE+H/R組(1.0×10^-3mol/L PUE預(yù)處理24 h后進(jìn)行H/R)。采用Western blot方法檢測(cè)內(nèi)皮型一氧化氮合酶（e NOS）蛋白的表達(dá),化學(xué)比色法檢測(cè)組成型一氧化氮合酶（c NOS）的活性,TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。此外,在PUE預(yù)處理前使用ERK蛋白激酶抑制劑U0126(1.0×10^-5mol/L)或PI3K/Akt蛋白激酶抑制劑LY294002(5.0×10^-5mol/L)處理細(xì)胞1 h,再進(jìn)行H/R。結(jié)果:與control組相比,H/R組的e NOS蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05）,PUE預(yù)處理上調(diào)e NOS蛋白的表達(dá)水平（P<0.05）,該上調(diào)作用均可被U0126及LY294002抑制（P<0.05）;與control組相比,H... 

【文章來源】：中國(guó)病理生理雜志. 2016,32(05)北大核心CSCD

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Ⅷ因子相關(guān)抗原和CD34在HUVECs細(xì)胞中的表達(dá)

Figure2．TheproteinexpressionofeNOSintheHUVECstreatedwithH/Ｒand/orPUE．Mean±SD．n=9．▲P＜0.05vscontrolgroup;#P＜0.05vsH2/Ｒ4group;△P＜0.05vsH4/Ｒ4group;*P＜0.05vsH8/Ｒ4group;☆P＜0.05vsPUEgroup．圖2H/Ｒ與PUE預(yù)處理各組eNOS蛋白表達(dá)3PUE預(yù)處理增加cNOS活性如圖3所示，與control組相比較，隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，H/Ｒ各組細(xì)胞cNOS活性逐漸降低(P＜0.05)，與同時(shí)點(diǎn)H/Ｒ組比較，應(yīng)用PUE預(yù)處理后各組cNOS活性明顯增加(P＜0.05)。Figure3．ThechangesofcNOSactivityineachgroup．Mean±SD．n=3．▲P＜0.05vscontrolgroup;#P＜0.05vsH2/Ｒ4group;△P＜0.05vsH4/Ｒ4group;*P＜0.05vsH8/Ｒ4group;☆P＜0.05vsPUEgroup．圖3各組cNOS活性的變化4PUE預(yù)處理減少HUVECs細(xì)胞凋亡Control組及PUE組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，僅偶見細(xì)胞凋亡發(fā)生。H4/Ｒ4組細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯高于control組(P＜0.01);經(jīng)PUE預(yù)處理后，細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低(P＜0.01)，見圖4、5。Figure4．TheapoptosisofHUVECs(TUNEL，×200)．A:negativecontrolgroup;B:controlgroup;C:H4/Ｒ4group;D:PUEgroup;E:PUE+H4/Ｒ4group．圖4HUVECs細(xì)胞凋亡情況5UO126及LY294002抑制PUE預(yù)處理上調(diào)的eNOS蛋白表達(dá)如圖6所示，與control組相比，H4/Ｒ4組eNOS蛋白表達(dá)水平降低(P＜0.05)，單純PUE預(yù)處理組和PUE+H4/Ｒ4組eNOS蛋白表達(dá)水平顯著增加(P＜0.05);與H4/Ｒ4組相比，PUE組和PUE+H4/Ｒ4組eNOS蛋白表達(dá)水平明顯增加(P＜0.05);與單純PUE預(yù)處理組比較，U0126+PUE+H4/Ｒ4組、U0126+PUE組、LY294002+PUE+H4/Ｒ4組和LY294002+PUE組eNOS蛋白表達(dá)水平降低(P＜·860·

?和LY294002+PUE組eNOS蛋白表達(dá)水平降低(P＜0.05);與control組相比，U0126組、LY294002組和DMSO組eNOS蛋白表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。討論當(dāng)IＲI發(fā)生時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能異常發(fā)生時(shí)間早于實(shí)質(zhì)細(xì)胞的損傷，且內(nèi)皮細(xì)胞受損可引起血栓和粥樣斑塊形成、血管痙攣，進(jìn)一步使實(shí)質(zhì)細(xì)胞的Figure6．U0126andLY294002inhibitedtheproteinexpressionofeNOSup-regulatedbyPUEpretreatment．Mean±SD．n=9．▲P＜0.05vscontrolgroup;△P＜0.05vsH4/Ｒ4group;#P＜0.05vsPUEgroup;*P＜0.05vsPUE+H4/Ｒ4group．圖6U0126及LY294002抑制PUE預(yù)處理上調(diào)的eNOS蛋白表達(dá)損傷加劇，因此有效保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞是預(yù)防和治療IＲI損傷的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)使用的HUVECs經(jīng)鑒定為高純度內(nèi)皮細(xì)胞，因此可用于模擬血管內(nèi)皮在H/Ｒ損傷時(shí)結(jié)構(gòu)和功能的改變。正常情況下，血管內(nèi)皮細(xì)胞可以通過eNOS分泌適量的NO來維持細(xì)胞正常氧化還原自穩(wěn)態(tài)。然而在H/Ｒ后，內(nèi)皮細(xì)胞可迅速生成大量的氧自由基，如超氧陰離子(O－·2)、羥自由基(OH－)等。有研究證實(shí)氧自由基可下調(diào)eNOS的mＲNA和eNOS蛋白表達(dá)［6］，我們也觀察到內(nèi)皮細(xì)胞在不同時(shí)點(diǎn)H/Ｒ后eNOS蛋白表達(dá)降低。本研究還測(cè)定了H/Ｒ后NOS活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)cNOS活性逐漸降低。cNOS包括了eNOS和神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronalnitricoxidesynthase，nNOS)，因此cNOS活性應(yīng)為兩者活性之和。nNOS主要表達(dá)于神經(jīng)細(xì)胞中，本實(shí)驗(yàn)過程中通過Westernblot方法檢測(cè)了各組內(nèi)皮細(xì)胞中nNOS蛋白表達(dá)，但未測(cè)出，且本課題組前期研究中使用免疫組化的方法也發(fā)現(xiàn)nNOS在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)水平很低［7］，故本實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的cNOS活性主要為eNOS活性，可見H/Ｒ后eNOS活性是明顯降低的。PUE是從豆科植物葛根提取

【參考文獻(xiàn)】：
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碩士論文
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本文編號(hào)：3413952