目的開發(fā)一種特異、靈敏的TaqMan MGB雙重探針實時熒光定量PCR方法,用于空腸彎曲菌的快速定量檢測。方法針對空腸彎曲菌鞭毛蛋白A和馬尿酸酶基因設(shè)計特異性引物和探針,建立一種新型TaqMan-MGB雙重探針實時熒光定量PCR檢測空腸彎曲菌方法,對該方法的定量檢測線性范圍、特異度、靈敏度、重復性、穩(wěn)定性進行評價,應用該方法對臨床標本中的空腸彎曲菌進行檢測,同時用細菌培養(yǎng)、普通PCR、基因克隆和測序鑒定。結(jié)果建立的空腸彎曲菌TaqMan MGB雙重探針實時熒光定量PCR檢測方法專屬性強,能準確檢出空腸彎曲菌,而與其他細菌無交叉反應,特異度為100%。該技術(shù)靈敏度高,能精確定量檢測空腸彎曲菌DNA線性范圍達10個數(shù)量級,最低檢測限為4個菌落形成單位。重復性和穩(wěn)定性良好,組內(nèi)和組間相對標準偏差均小于1%。應用該方法成功從78例臨床標本中定量檢出28例空腸彎曲菌陽性標本,用普通PCR和基因克隆測序分析確認,細菌培養(yǎng)方法僅獲得6株存活的空腸彎曲菌。結(jié)論 TaqMan MGB雙重探針實時熒光定量PCR具有快速簡便、可靠穩(wěn)定、特異靈敏的優(yōu)點,可用于臨床標本中空腸彎曲菌定量檢測,值得推廣應用。 

【文章來源】：現(xiàn)代檢驗醫(yī)學雜志. 2019,34(06)

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

空腸彎曲菌TaqMan-MGB雙重探針實時熒光定量PCR標準曲線、特異度、敏感度試驗結(jié)果

用本研究建立的TaqMan-MGB雙重探針實時熒光定量PCR對臨床標本進行空腸彎曲菌檢測，用陰性對照、陽性對照和靈敏度質(zhì)控標準品進行有效性驗證。質(zhì)量控制原則：陰性對照：未出現(xiàn)特異性擴增曲線或Ct=Undet；陽性對照：出現(xiàn)特異性擴增曲線或Ct≤30.0；靈敏度質(zhì)控標準品出現(xiàn)特異性擴增曲線且Ct值在15.0～30.0之間，以上要求必須在同一實驗中同時滿足，否則本次實驗無效。檢驗結(jié)果的判定：當待測樣本出現(xiàn)特異性擴增曲線且Ct≤35.0時為空腸彎曲菌核酸陽性；當待測樣本未出現(xiàn)特異性擴增曲線或Ct=Undet時為空腸彎曲菌核酸陰性；對于Ct>35.0的樣本，應重新檢測，Ct值仍>35.0的樣本判為陰性，Ct≤35.0的樣本判為陽性。78份臨床標本經(jīng)檢測：28份標本出現(xiàn)特異性擴增曲線且Ct<30.0，判為空腸彎曲菌核酸陽性（圖2）。陽性標本中空腸彎曲菌核酸載量在4×106拷貝/μl～4×102拷貝/μl之間。由圖可知，臨床病人標本、猴、犬標本中空腸彎曲菌核酸載量較高，小型豬、地鼠標本中該菌核酸載量較低。臨床病人1例空腸彎曲菌陽性Ct值為15.71，猴4例Ct值分別為15.72,11.7,29.75和28.28。犬5例Ct值分別為13.59,12.73,12.97,29.28和21.74。小型豬12例Ct值分別為：27.54,26.84,27.1,26.79,28.19,28.02,28.51,27.21,26.95,28.19,26.03和27.41。地鼠6例Ct值分別為：26.55,25.72,29.77,29.67,29.25和26.31。同時用普通PCR對這28例空腸彎曲菌核酸陽性標本進行flaA基因擴增，均出現(xiàn)1 719 bp特異性目的基因片段（圖3），分子量標準為100bp DNA Ladder Marker。結(jié)果表明：普通PCR檢測結(jié)果與TaqMan-MGB雙重探針實時熒光定量PCR檢測結(jié)果相一致。用細菌學檢查方法僅從臨床病人、猴、犬、小型豬陽性標本中分離獲得6株存活的空腸彎曲菌。用普通PCR均可擴增出這6株空腸彎曲菌flaA基因特異性片段，目的片段經(jīng)膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、克隆鑒定，陽性菌液測序，序列分析比對結(jié)果顯示與GenBank中已公布的空腸彎曲菌flaA基因序列同源性達100%，確證為空腸彎曲菌。圖3 普通PCR檢測臨床樣本中空腸彎曲菌結(jié)果

普通PCR檢測臨床樣本中空腸彎曲菌結(jié)果

【參考文獻】：
期刊論文
[1]Reaction of antibodies to Campylobacter jejuni and cytolethal distending toxin B with tissues and food antigens[J]. Aristo Vojdani,Elroy Vojdani.  World Journal of Gastroenterology. 2019(09)



本文編號：3414065