目的開發(fā)一種特異、靈敏的TaqMan MGB雙重探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,用于空腸彎曲菌的快速定量檢測(cè)。方法針對(duì)空腸彎曲菌鞭毛蛋白A和馬尿酸酶基因設(shè)計(jì)特異性引物和探針,建立一種新型TaqMan-MGB雙重探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)空腸彎曲菌方法,對(duì)該方法的定量檢測(cè)線性范圍、特異度、靈敏度、重復(fù)性、穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià),應(yīng)用該方法對(duì)臨床標(biāo)本中的空腸彎曲菌進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)用細(xì)菌培養(yǎng)、普通PCR、基因克隆和測(cè)序鑒定。結(jié)果建立的空腸彎曲菌TaqMan MGB雙重探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法專屬性強(qiáng),能準(zhǔn)確檢出空腸彎曲菌,而與其他細(xì)菌無(wú)交叉反應(yīng),特異度為100%。該技術(shù)靈敏度高,能精確定量檢測(cè)空腸彎曲菌DNA線性范圍達(dá)10個(gè)數(shù)量級(jí),最低檢測(cè)限為4個(gè)菌落形成單位。重復(fù)性和穩(wěn)定性良好,組內(nèi)和組間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1%。應(yīng)用該方法成功從78例臨床標(biāo)本中定量檢出28例空腸彎曲菌陽(yáng)性標(biāo)本,用普通PCR和基因克隆測(cè)序分析確認(rèn),細(xì)菌培養(yǎng)方法僅獲得6株存活的空腸彎曲菌。結(jié)論 TaqMan MGB雙重探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有快速簡(jiǎn)便、可靠穩(wěn)定、特異靈敏的優(yōu)點(diǎn),可用于臨床標(biāo)本中空腸彎曲菌定量檢測(cè),值得推廣應(yīng)用。 

【文章來(lái)源】：現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志. 2019,34(06)

【文章頁(yè)數(shù)】：6 頁(yè)

【部分圖文】：

空腸彎曲菌TaqMan-MGB雙重探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線、特異度、敏感度試驗(yàn)結(jié)果

用本研究建立的TaqMan-MGB雙重探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行空腸彎曲菌檢測(cè)，用陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和靈敏度質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行有效性驗(yàn)證。質(zhì)量控制原則：陰性對(duì)照：未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線或Ct=Undet；陽(yáng)性對(duì)照：出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線或Ct≤30.0；靈敏度質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線且Ct值在15.0～30.0之間，以上要求必須在同一實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則本次實(shí)驗(yàn)無(wú)效。檢驗(yàn)結(jié)果的判定：當(dāng)待測(cè)樣本出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線且Ct≤35.0時(shí)為空腸彎曲菌核酸陽(yáng)性；當(dāng)待測(cè)樣本未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線或Ct=Undet時(shí)為空腸彎曲菌核酸陰性；對(duì)于Ct>35.0的樣本，應(yīng)重新檢測(cè)，Ct值仍>35.0的樣本判為陰性，Ct≤35.0的樣本判為陽(yáng)性。78份臨床標(biāo)本經(jīng)檢測(cè)：28份標(biāo)本出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線且Ct<30.0，判為空腸彎曲菌核酸陽(yáng)性（圖2）。陽(yáng)性標(biāo)本中空腸彎曲菌核酸載量在4×106拷貝/μl～4×102拷貝/μl之間。由圖可知，臨床病人標(biāo)本、猴、犬標(biāo)本中空腸彎曲菌核酸載量較高，小型豬、地鼠標(biāo)本中該菌核酸載量較低。臨床病人1例空腸彎曲菌陽(yáng)性Ct值為15.71，猴4例Ct值分別為15.72,11.7,29.75和28.28。犬5例Ct值分別為13.59,12.73,12.97,29.28和21.74。小型豬12例Ct值分別為：27.54,26.84,27.1,26.79,28.19,28.02,28.51,27.21,26.95,28.19,26.03和27.41。地鼠6例Ct值分別為：26.55,25.72,29.77,29.67,29.25和26.31。同時(shí)用普通PCR對(duì)這28例空腸彎曲菌核酸陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行flaA基因擴(kuò)增，均出現(xiàn)1 719 bp特異性目的基因片段（圖3），分子量標(biāo)準(zhǔn)為100bp DNA Ladder Marker。結(jié)果表明：普通PCR檢測(cè)結(jié)果與TaqMan-MGB雙重探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果相一致。用細(xì)菌學(xué)檢查方法僅從臨床病人、猴、犬、小型豬陽(yáng)性標(biāo)本中分離獲得6株存活的空腸彎曲菌。用普通PCR均可擴(kuò)增出這6株空腸彎曲菌flaA基因特異性片段，目的片段經(jīng)膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、克隆鑒定，陽(yáng)性菌液測(cè)序，序列分析比對(duì)結(jié)果顯示與GenBank中已公布的空腸彎曲菌flaA基因序列同源性達(dá)100%，確證為空腸彎曲菌。圖3 普通PCR檢測(cè)臨床樣本中空腸彎曲菌結(jié)果

普通PCR檢測(cè)臨床樣本中空腸彎曲菌結(jié)果

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Reaction of antibodies to Campylobacter jejuni and cytolethal distending toxin B with tissues and food antigens[J]. Aristo Vojdani,Elroy Vojdani.  World Journal of Gastroenterology. 2019(09)



本文編號(hào)：3414065