腸道病毒71型（Enterovirus 71,EV71）屬于小RNA病毒科,腸道病毒屬,腸道病毒A型的成員,是引起嬰幼兒手足口�。℉and foot and mouth disease,HFMD）的一種重要病原病毒。但截至目前,EV71病毒與宿主細(xì)胞相互作用的機(jī)制仍不清楚。為了研究EV71病毒誘導(dǎo)應(yīng)激顆粒形成的分子機(jī)制,研究首先構(gòu)建了真核表達(dá)載體pDsRed2-G3BP1,隨后構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)融合蛋白R(shí)FP-G3BP1蛋白的HeLa細(xì)胞系（HeLaRFP-G3BP1）,并應(yīng)用Western Blot和免疫熒光技術(shù)證實(shí)了G3BP1融合蛋白的正確表達(dá)。EV71病毒感染HeLaRFP-G3BP1后,超過40%感染細(xì)胞的胞質(zhì)中出現(xiàn)了應(yīng)激顆粒。此外,應(yīng)用微管特異性抑制劑破壞細(xì)胞微管完整性之后,顯著抑制應(yīng)激顆粒的遷移聚集。研究證明了EV71病毒誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激顆粒的初步形成并且應(yīng)激顆粒的遷移聚集依賴于微管的完整性。 

【文章來(lái)源】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào). 2019,31(05)

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3BP1基因片段的PCR擴(kuò)增Fig.1PCRAmplificationofG3BP1genefragment

鰨?肨rizol試劑提取HeLa細(xì)胞的總RNA，進(jìn)行濃度測(cè)定之后，反轉(zhuǎn)錄出cDNA第一條鏈，然后再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段大小為1398bp的目的條帶，即為特異的G3BP1基因片段，結(jié)果如圖1。2.2重組質(zhì)粒pDsRed2-G3BP1的PCR鑒定將PCR擴(kuò)增后目的基因與真核表達(dá)載體pDsRed2進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。利用T4連接酶將酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，將G3BP1插入BamHI/HindIII位點(diǎn)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化及提取質(zhì)粒后得到重組質(zhì)粒pDsRed2-G3BP1。用常規(guī)方法進(jìn)行PCR鑒定，電泳發(fā)現(xiàn)在1398bp附近處有單一明亮目的條帶，符合理論設(shè)計(jì)結(jié)果，結(jié)果如圖2。2.3重組質(zhì)粒pDsRed2-G3BP1雙酶切鑒定經(jīng)PCR初步鑒定后，取少量結(jié)果為陽(yáng)性的質(zhì)粒，加入BamHI和HindIII兩種酶置于37℃水浴鍋中，將重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，雙酶切結(jié)果得到片段大小約為1398bp和4689bp的兩條目的條帶，得到結(jié)果與預(yù)期理論設(shè)計(jì)結(jié)果相符，結(jié)果如圖3。取10μLpDsRed2-G3BP1質(zhì)粒送至北京生物公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，研究正確克隆了G3BP1基因，獲得了正確的重組質(zhì)粒pDsRed2-G3BP1。2.4RFP-G3BP1融合蛋白的檢測(cè)應(yīng)激顆粒組分包括諸多RNA結(jié)合蛋白（RBP），如G3BP1、TIA1、HuR等[17]。研究將重組真核表達(dá)載體pDsRed2-G3BP1轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，24~48h后，用鼠抗RFP單克隆抗體進(jìn)行WesternBlot檢測(cè)，結(jié)果顯示在70KD附近出現(xiàn)目的條帶，結(jié)果如圖4，說(shuō)明構(gòu)建的真核載體能能夠正確表達(dá)融合蛋白。M：DL5000marker；1：G3BP1基因圖2重組質(zhì)粒pDsRed2-G3BP1的PCR鑒定Fig.2IdentificationofrecombinantplasmidpDsRed2-G3BP1usingPCRM：DL5000marker；1：G3BP1基因圖1G3BP1基因片段的PCR擴(kuò)增Fig.1PCRAmplificationofG3BP1genefragmentM：DL5000marker；1：pDsRed2；2：pDsRed2

pDsRed2進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。利用T4連接酶將酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，將G3BP1插入BamHI/HindIII位點(diǎn)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化及提取質(zhì)粒后得到重組質(zhì)粒pDsRed2-G3BP1。用常規(guī)方法進(jìn)行PCR鑒定，電泳發(fā)現(xiàn)在1398bp附近處有單一明亮目的條帶，符合理論設(shè)計(jì)結(jié)果，結(jié)果如圖2。2.3重組質(zhì)粒pDsRed2-G3BP1雙酶切鑒定經(jīng)PCR初步鑒定后，取少量結(jié)果為陽(yáng)性的質(zhì)粒，加入BamHI和HindIII兩種酶置于37℃水浴鍋中，將重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，雙酶切結(jié)果得到片段大小約為1398bp和4689bp的兩條目的條帶，得到結(jié)果與預(yù)期理論設(shè)計(jì)結(jié)果相符，結(jié)果如圖3。取10μLpDsRed2-G3BP1質(zhì)粒送至北京生物公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，研究正確克隆了G3BP1基因，獲得了正確的重組質(zhì)粒pDsRed2-G3BP1。2.4RFP-G3BP1融合蛋白的檢測(cè)應(yīng)激顆粒組分包括諸多RNA結(jié)合蛋白（RBP），如G3BP1、TIA1、HuR等[17]。研究將重組真核表達(dá)載體pDsRed2-G3BP1轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，24~48h后，用鼠抗RFP單克隆抗體進(jìn)行WesternBlot檢測(cè)，結(jié)果顯示在70KD附近出現(xiàn)目的條帶，結(jié)果如圖4，說(shuō)明構(gòu)建的真核載體能能夠正確表達(dá)融合蛋白。M：DL5000marker；1：G3BP1基因圖2重組質(zhì)粒pDsRed2-G3BP1的PCR鑒定Fig.2IdentificationofrecombinantplasmidpDsRed2-G3BP1usingPCRM：DL5000marker；1：G3BP1基因圖1G3BP1基因片段的PCR擴(kuò)增Fig.1PCRAmplificationofG3BP1genefragmentM：DL5000marker；1：pDsRed2；2：pDsRed2-G3BP1圖3重組質(zhì)粒pDsRed2-G3BP1的雙酶切分析Fig.3DoubleenzymedigestionanalysisofrecombinantplasmidpDsRed2-G3BP11.HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染空載體；2.HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染pDsRed2-G3BP1圖4檢測(cè)RFP-G3BP1融合蛋白表達(dá)Fig.4DetectionofexpressionofRFP-G3BP1fusionprotein86

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]核蛋白Sam68的原核表達(dá)及鑒定[J]. 張華,陳寧,丁筠,鄒德華,潘子夜,李鵬飛,李麗陽(yáng),肖麗杰,曹宏偉.  黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào). 2017(03)



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