基孔肯雅病毒nsP1蛋白棕櫚�；难芯�
發(fā)布時(shí)間：2021-09-01 10:06
棕櫚�；堑鞍踪|(zhì)翻譯后脂類修飾的重要形式,通過(guò)調(diào)控蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、穩(wěn)定性和定位來(lái)影響蛋白的功能,S棕櫚�；且环N較常見(jiàn)的棕櫚酰化形式�；卓涎挪《緦儆谂げ《究萍撞《緦�,是一種單股正鏈RNA病毒。本論文中我們利用蛋白棕櫚�；A(yù)測(cè)軟件對(duì)基孔肯雅病毒nsP1的S棕櫚�；稽c(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)其S棕櫚�；稽c(diǎn)位于C417-419。我們分別構(gòu)建了這一區(qū)域的單點(diǎn)突變和三點(diǎn)突變的質(zhì)粒,通過(guò)棕櫚�；瘜�(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這三個(gè)位點(diǎn)是nsP1蛋白S棕櫚�；年P(guān)鍵位點(diǎn)。已有研究表明,脂肪酸合成酶抑制劑能抑制基孔肯雅病毒復(fù)制,但其機(jī)制還不清楚。我們發(fā)現(xiàn)脂肪酸合成酶的重要產(chǎn)物——棕櫚酸能夠拯救脂肪酸合成酶抑制劑對(duì)病毒復(fù)制的抑制作用,該結(jié)果暗示,脂肪酸合成酶抑制劑對(duì)病毒的抑制可能是因?yàn)閚sP1蛋白的S棕櫚酰化受到影響。蛋白的S棕櫚�；饕怯删哂袖\指D-H-H-C結(jié)構(gòu)域的棕櫚�；D(zhuǎn)移酶（zinc-finger D-H-H-C domain containing-palmitoyltransferase,ZDHHC）所介導(dǎo)的,而基孔肯雅病毒的nsP1是由哪個(gè)棕櫚酰化轉(zhuǎn)移酶所催化還不清楚。在本研究中,我們?cè)噲D篩選影響基孔肯雅病毒ns...
【文章來(lái)源】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京市 211工程院校 985工程院校
【文章頁(yè)數(shù)】：73 頁(yè)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【部分圖文】：
圖２．?ｎｓＰｌ蛋白分區(qū)??Ｆｉｇｕｒｅ?２．?Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ?ｎｓＰｌ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ??
?碩士學(xué)位論文???三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果??３．１基孔肯雅病毒的制備??制備基孔肯雅病毒的質(zhì)粒ｐＳｉｎＲｅｐ５－１８１／２５ｉｃ是從ａｄｄｇｅｎｅ購(gòu)得，該基因是基孔??肯雅病毒疫苗株，因此，病毒可在Ｐ２實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作。首先，我們將該質(zhì)粒線性??化，所選酶切位點(diǎn)是Ｎｏｔｌ，然后進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，得到病毒ＲＮＡ，然后電擊到細(xì)胞??中，保險(xiǎn)起見(jiàn)，我們電擊到兩種細(xì)胞中——ＨｅＬａ和Ｈｕｈ７．５．１細(xì)胞，收集上清中的??病毒，測(cè)病毒滴度，用于接下來(lái)的病毒實(shí)驗(yàn)。圖３是用得到的病毒上清侵染ＨｅＬａ??細(xì)胞后ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ和免疫熒光檢測(cè)病毒侵染情況，我們通過(guò)檢測(cè)ｎｓＰｌ判斷是否產(chǎn)??生病毒。??
將細(xì)胞裂解，進(jìn)行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝膠電泳，ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ分析，檢測(cè)脂肪酸??合成酶和ｎｓＰｌ蛋白的表達(dá)，ａｃｔｉｎ作為內(nèi)參蛋白。從圖中可以看出，在基孔肯雅病??毒侵染后，脂肪酸合成酶蛋白的表達(dá)量有所提高（圖７Ｂ）。??■ＨＯＢ??ＣＨＩＫＶ?－?＋??ＦＡＳＮ?一??ｎｓＰ１?＾??Ａｃｔ?ｉｎ?？著??圖７．基孔肯雅病毒侵染后脂肪酸合成酶表達(dá)上調(diào)??Ｆｉｇｕｒｅ?７．?ＣＨＩＫＶ?ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ?ｉｎｄｕｃｅｓ?ＦＡＳＮ?ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ??Ａ．將ＨｅＬａ細(xì)胞鋪到小玻片上，基孔肯雅病毒侵染或不侵染，８小時(shí)后使用４％ＰＦＡ固定細(xì)胞，??封閉液封閉后用ａｎｔｉ－ＦＡＳＮ、ａｎｔｉ－ｄｓＲＮＡ進(jìn)行染色，細(xì)胞核用ＤＡＰＩ染色，用激光共聚焦顯微鏡??檢測(cè)病毒侵染前后脂肪酸合成酶在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。Ｂ．基孔肯雅病毒（ＭＯＩ＝ｌ）侵染或不侵??染ＨｅＬａ細(xì)胞，８小時(shí)后，去掉上清，ＰＢＳ洗３次，每孔加入６〇４的裂解液，各�。博枺戳呀庖�??進(jìn)行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝膠電泳，通過(guò)ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ方法使用ａｎｔｉ－ｎｓＰｌ抗體和ａｎｔｉ－ＦＡＳＮ抗體檢測(cè)病??毒蛋白以及脂肪酸合成合成酶的表達(dá)情況
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Interplay between hepatitis C virus and ARF4[J]. Na Zhang,Youyang Ke,Leiliang Zhang. Virologica Sinica. 2017(06)
本文編號(hào)：3376786
【文章來(lái)源】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京市 211工程院校 985工程院校
【文章頁(yè)數(shù)】：73 頁(yè)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【部分圖文】：
圖２．?ｎｓＰｌ蛋白分區(qū)??Ｆｉｇｕｒｅ?２．?Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ?ｎｓＰｌ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ??
?碩士學(xué)位論文???三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果??３．１基孔肯雅病毒的制備??制備基孔肯雅病毒的質(zhì)粒ｐＳｉｎＲｅｐ５－１８１／２５ｉｃ是從ａｄｄｇｅｎｅ購(gòu)得，該基因是基孔??肯雅病毒疫苗株，因此，病毒可在Ｐ２實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作。首先，我們將該質(zhì)粒線性??化，所選酶切位點(diǎn)是Ｎｏｔｌ，然后進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，得到病毒ＲＮＡ，然后電擊到細(xì)胞??中，保險(xiǎn)起見(jiàn)，我們電擊到兩種細(xì)胞中——ＨｅＬａ和Ｈｕｈ７．５．１細(xì)胞，收集上清中的??病毒，測(cè)病毒滴度，用于接下來(lái)的病毒實(shí)驗(yàn)。圖３是用得到的病毒上清侵染ＨｅＬａ??細(xì)胞后ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ和免疫熒光檢測(cè)病毒侵染情況，我們通過(guò)檢測(cè)ｎｓＰｌ判斷是否產(chǎn)??生病毒。??
將細(xì)胞裂解，進(jìn)行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝膠電泳，ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ分析，檢測(cè)脂肪酸??合成酶和ｎｓＰｌ蛋白的表達(dá)，ａｃｔｉｎ作為內(nèi)參蛋白。從圖中可以看出，在基孔肯雅病??毒侵染后，脂肪酸合成酶蛋白的表達(dá)量有所提高（圖７Ｂ）。??■ＨＯＢ??ＣＨＩＫＶ?－?＋??ＦＡＳＮ?一??ｎｓＰ１?＾??Ａｃｔ?ｉｎ?？著??圖７．基孔肯雅病毒侵染后脂肪酸合成酶表達(dá)上調(diào)??Ｆｉｇｕｒｅ?７．?ＣＨＩＫＶ?ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ?ｉｎｄｕｃｅｓ?ＦＡＳＮ?ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ??Ａ．將ＨｅＬａ細(xì)胞鋪到小玻片上，基孔肯雅病毒侵染或不侵染，８小時(shí)后使用４％ＰＦＡ固定細(xì)胞，??封閉液封閉后用ａｎｔｉ－ＦＡＳＮ、ａｎｔｉ－ｄｓＲＮＡ進(jìn)行染色，細(xì)胞核用ＤＡＰＩ染色，用激光共聚焦顯微鏡??檢測(cè)病毒侵染前后脂肪酸合成酶在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。Ｂ．基孔肯雅病毒（ＭＯＩ＝ｌ）侵染或不侵??染ＨｅＬａ細(xì)胞，８小時(shí)后，去掉上清，ＰＢＳ洗３次，每孔加入６〇４的裂解液，各�。博枺戳呀庖�??進(jìn)行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝膠電泳，通過(guò)ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ方法使用ａｎｔｉ－ｎｓＰｌ抗體和ａｎｔｉ－ＦＡＳＮ抗體檢測(cè)病??毒蛋白以及脂肪酸合成合成酶的表達(dá)情況
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Interplay between hepatitis C virus and ARF4[J]. Na Zhang,Youyang Ke,Leiliang Zhang. Virologica Sinica. 2017(06)
本文編號(hào)：3376786
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