目的構(gòu)建人可溶性Tim-3（sTim-3）的重組質(zhì)粒表達(dá)載體pET28a-sTim-3-EGFP,在大腸埃希菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)并對(duì)其表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。方法取健康人外周血提取總RNA,RT-PCR擴(kuò)增Tim-3基因胞外段序列,克隆入已構(gòu)建的表達(dá)載體pET28a-EGFP中,鑒定陽性克隆。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）,通過調(diào)整IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)溫度與誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化蛋白表達(dá)條件。結(jié)果成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a-sTim-3-EGFP,并轉(zhuǎn)化BL21（DE3）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。溫度和IPTG濃度對(duì)蛋白表達(dá)量影響不大;在培養(yǎng)至A600nm值約為0.6⁰.8時(shí)于25℃誘導(dǎo)5h可獲得較高的蛋白表達(dá)。結(jié)論成功表達(dá)可溶性重組蛋白sTim-3-EGFP,為該蛋白的進(jìn)一步純化生產(chǎn)及應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)。 

【文章來源】：華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版). 2017,46(03)北大核心CSCD

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圖４熒光顯微鏡觀察ｓＴｉｍ－３－ＥＧＦＰ融合蛋白的表達(dá)（×４００）Ｆｉｇ．４ＭｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｓＴｉｍ－３－ＥＧＦＰｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｅｘ－

ＩＰＴＧ誘導(dǎo)為最佳。２．３．３ｓＴｉｍ－３－ＥＧＦＰ重組蛋白的誘導(dǎo)時(shí)間及溫度最佳化經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)ＩＰＴＧ誘導(dǎo)６ｈ以上，蛋白表達(dá)無變化。為了找出ＩＰＴＧ誘導(dǎo)表達(dá)的最佳溫度與誘導(dǎo)時(shí)間，我們分別進(jìn)行不同時(shí)間及溫度的誘導(dǎo)表達(dá)（圖７），可見２５℃誘導(dǎo)５ｈ蛋白達(dá)到最大表達(dá)量，隨時(shí)間增加表達(dá)量不再增加，不同溫度誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)表達(dá)量區(qū)別不大。為了減少ｓＴｉｍ－３－ＥＧＦＰ重組蛋白的降解，確定ＩＰＴＧ誘導(dǎo)表達(dá)的最佳溫度與誘導(dǎo)時(shí)間為２５℃誘導(dǎo)５ｈ。圖４熒光顯微鏡觀察ｓＴｉｍ－３－ＥＧＦＰ融合蛋白的表達(dá)（×４００）Ｆｉｇ．４ＭｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｓＴｉｍ－３－ＥＧＦＰｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｅｘ－ｐｒｅｓｓｉｏｎ（×４００）Ａ：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳及考馬斯亮藍(lán)染色；①：蛋白Ｍａｒｋｅｒ；②～⑨：ｐＥＴ２８ａ－ｓＴｉｍ－３－ＥＧＦＰ重組質(zhì)粒組誘導(dǎo)前及０．０５、０．１、０．２５、０．５、１．０、２．０、５．０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ濃度下２８℃誘導(dǎo)表達(dá)６ｈ；⑩：ｐＥＴ２８ａ空質(zhì)粒對(duì)照組。Ｂ：采用Ｈｉｓ標(biāo)簽單抗及ＥＧＦＰ單抗對(duì)重組蛋白進(jìn)行的驗(yàn)證圖５不同ＩＰＴＧ濃度誘導(dǎo)下蛋白的表達(dá)及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ驗(yàn)證Ｆｉｇ．５ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓＴｉｍ－３－ＥＧＦＰｐｒｏｔｅｉｎｉｎｄｕｃｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎ－ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＩＰＴＧａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ①：蛋白Ｍａｒｋｅｒ；②：ｐＥＴ２８ａ－ｓＴｉｍ－３－ＥＧＦＰ


本文編號(hào)：3360110