目的:構(gòu)建p-KPNA2、p-HBs Ag、p-HBs Agt三種質(zhì)粒,通過分組分別轉(zhuǎn)染Hep G2細胞、LO2細胞和293T細胞,探討KPNA2過表達在rt A181T型乙肝病毒表面蛋白上調(diào)c-Myc表達過程中的作用。方法:（1）從Gen Bank中分別查找KPNA2、HBs Ag的m RNA序列,利用primer premier 5.0軟件設(shè)計引物,應(yīng)用RT-PCR方法獲得目的片段,雙酶切后與真核表達質(zhì)粒連接,從而構(gòu)建成p-KPNA2、p-HBs Ag質(zhì)粒;（2）以構(gòu)建好的p-HBs Ag質(zhì)粒為模板,采用定點突變方法使其產(chǎn)生rt A181T突變以構(gòu)建p-HBs Agt質(zhì)粒;（3）分組與轉(zhuǎn)染:①p-HBs Ag組、②p-HBs Agt組、③p-KPNA2組、④p-KPNA2+p-HBs Ag組、⑤p-KPNA2+p-HBs Agt組、⑥空載質(zhì)粒組,共6組;分別轉(zhuǎn)染Hep G2細胞、LO2細胞、293T細胞;（4）檢測:轉(zhuǎn)染48h后,采用Ligand綠色熒光染料染色技術(shù)檢測KPNA2的細胞內(nèi)分布;收集細胞總蛋白,western blot檢測目的蛋白的表達并進行灰度值分析;收集細胞總RN... 

【文章來源】：南昌大學(xué)江西省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
中英文對照詞表
第1章 引言
第2章 材料與方法
    2.1 實驗主要試劑和材料
    2.2 實驗主要設(shè)備和儀器
    2.3 實驗主要試劑的配制
    2.4 pFC14A-KPNA2 質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.4.1 KPNA2 基因mRNA序列的引物設(shè)計
        2.4.2 提取HepG2 細胞總RNA
        2.4.3 RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA
        2.4.4 PCR擴增KPNA2 基因
        2.4.5 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳回收
        2.4.6 回收產(chǎn)物和pFC14A質(zhì)粒的雙酶切，回收以及連接
        2.4.7 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，篩選，提取和鑒定
    2.5 pcDNA3.1-HBsAg質(zhì)粒的構(gòu)建
    2.6 pcDNA3.1-HBsAgt質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.6.1 點突變引物的設(shè)計
        2.6.2 PCR反應(yīng)程序
    2.7 pFC14A-KPNA2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2 細胞
    2.8 pcDNA3.1-HBsAg質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2 細胞
    2.9 HepG2 細胞免疫熒光實驗
    2.10 p-KPNA2、p-HBsAg、p-HBsAgt三種質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染
    2.11 western blot檢測HepG2、LO2 和 293T細胞內(nèi)c-Myc表達水平
        2.11.1 細胞中總蛋白的提取
    2.12 RTFQ-PCR檢測LO2 細胞中c-Myc的mRNA表達水平
        2.12.1 RNA提取
        2.12.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
        2.12.3 熒光定量PCR反應(yīng)體系和程序
    2.13 數(shù)據(jù)處理
第3章 結(jié)果
    3.1 成功構(gòu)建pFC14A-KPNA2 質(zhì)粒
        3.1.1 pFC14A-KPNA2 質(zhì)粒酶切結(jié)果鑒定
        3.1.2 pFC14A-KPNA2 質(zhì)粒測序結(jié)果鑒定
    3.2 成功構(gòu)建pcDNA3.1-HBsAg質(zhì)粒
        3.2.1 pcDNA3.1-HBsAg質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果
        3.2.2 pcDNA3.1-HBsAg質(zhì)粒測序鑒定結(jié)果
    3.3 成功構(gòu)建pcDNA3.1-HBsAgt質(zhì)粒
        3.3.1 pcDNA3.1-HBsAgt質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果
        3.3.2 pcDNA3.1-HBsAgt質(zhì)粒測序鑒定結(jié)果
    3.4 pFC14A-KPNA2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2 細胞
    3.5 pcDNA3.1-HBsAg質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2 細胞
    3.6 c-Myc在HepG2 細胞中的表達水平
    3.7 c-Myc在LO2 細胞中的表達水平
    3.8 c-Myc在 293T細胞中的表達水平
    3.9 LO2 細胞中p-HBsAg組、p-HBsAgt組和p-HBsAgt+p-KPNA2 組的c-Myc的mRNA表達水平
    3.10 p-HBsAgt對不同細胞中c-Myc的表達影響
第4章 討論
第5章 結(jié)論
致謝
參考文獻
綜述
    參考文獻


【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3244356