本文關(guān)鍵詞：抗TRPM2兔單克隆抗體制備及初步鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景抗體從多克隆發(fā)展到單克隆抗體藥物,已被廣泛應(yīng)用于生物科學(xué)及醫(yī)藥研發(fā)技術(shù)產(chǎn)品中。相比鼠單克隆抗體而言,兔單克隆抗體具有高親和力,特異性強(qiáng),易于人源化等優(yōu)點(diǎn)。TRPM2(Transient receptor potential channels melastatin,瞬時受體電位通道M型2)是Ca2+非選擇性陽離子通道,受ADPR(Adenosine diphosphate ribose,二磷酸腺苷核糖)和H202激活調(diào)控胞內(nèi)Ca2+濃度,從而對細(xì)胞的各項生理功能進(jìn)行調(diào)控,與能量代謝修復(fù)和氧化應(yīng)激相關(guān)的病理性疾病有關(guān)。目前市面上主要是TRPM2多克隆抗體,其特異性和親和力并不是十分理想。目的制備TRPM2兔單克隆抗體。方法本實(shí)驗(yàn)設(shè)計合成了三段TRPM2多肽,YCA-10987, YCA-10988和YCA-10989,每段多肽免疫三只實(shí)驗(yàn)兔。經(jīng)過血清blot實(shí)驗(yàn)初步篩選,將可能免疫了TRPM2兔脾細(xì)胞與240E兔骨髓瘤樣細(xì)胞株融合,產(chǎn)生能分泌TRPM2抗體的兔-兔雜交瘤細(xì)胞,用HAT作為選擇性培養(yǎng)基對融合后的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),運(yùn)用ELISA法和WB法,篩選獲得陽性克隆,選取其中WB信號最強(qiáng)的克隆進(jìn)入抗體質(zhì)粒重組階段,再進(jìn)一步篩選,選取分泌單克隆抗體最強(qiáng)的配對進(jìn)入單克隆抗體大轉(zhuǎn)生產(chǎn)。結(jié)果YCA-10988免疫失敗。YCA-10987和YCA-10989在WB應(yīng)用上有差異,YCA-10987在過表達(dá)裂解液中能檢測出強(qiáng)信號,但在細(xì)胞裂解液中檢測出很弱的信號,而YCA-10989與YCA-10987相反。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)設(shè)計合成了三段TRPM2多肽,通過雜交瘤和重組技術(shù),獲得YCA-10987和YCA-10989兩個不同位點(diǎn)TRPM2兔單克隆抗體,兩者在WB應(yīng)用上有差異,但可滿足檢測需要,有潛在應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：兔單克隆抗體 TRPM2
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392
【目錄】：

• 致謝5-6
• 主要縮略詞6-7
• 摘要7-8
• ABSTRACT8-12
• 1 緒論12-23
• 1.1 多克隆抗體技術(shù)12
• 1.2 單克隆抗體技術(shù)12-17
• 1.2.1 單克隆抗體技術(shù)研究歷史和現(xiàn)狀12-13
• 1.2.2 單克隆抗體技術(shù)研究原理13-14
• 1.2.3 制備單克隆抗體的骨髓瘤細(xì)胞14-15
• 1.2.4 兔單克隆抗體優(yōu)勢15-17
• 1.3 TRP通道17-23
• 1.3.1 TRPM2的命名和分子結(jié)構(gòu)18-19
• 1.3.2 TRPM2分布19
• 1.3.3 TRPM2與中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病19-23
• 2 抗TRPM2兔單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞的制備23-36
• 引言23
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料23-26
• 2.1.1 免疫原23
• 2.1.2 細(xì)胞來源23-24
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)動物24
• 2.1.4 主要儀器設(shè)備24
• 2.1.5 主要試劑及配置24-26
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法26-31
• 2.2.1 免疫26
• 2.2.2 抗血清效價測定26-27
• 2.2.3 血清特異性檢測27-30
• 2.2.4 細(xì)胞融合30-31
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析31-35
• 2.3.1 兔抗血清效價31-32
• 2.3.2 血清WB初步判定32-34
• 2.3.3 細(xì)胞融合結(jié)果34-35
• 2.4 討論35-36
• 3 抗TRPM2兔單克隆抗體重組開發(fā)36-48
• 引言36
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料36-37
• 3.1.1 TRPM2抗體基因序列36
• 3.1.2 細(xì)胞來源36
• 3.1.3 主要儀器設(shè)備36
• 3.1.4 主要試劑36-37
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法37-43
• 3.2.1 制備重組抗體37-43
• 3.3 重組技術(shù)生產(chǎn)TRPM2兔單克隆抗體結(jié)果43-47
• 3.3.1 HC和LC PCR結(jié)果43
• 3.3.2 HC質(zhì)粒和LC質(zhì)粒酶切結(jié)果43
• 3.3.3 小轉(zhuǎn)檢測結(jié)果43-44
• 3.3.4 大轉(zhuǎn)檢測結(jié)果44-47
• 3.5 討論47-48
• 4 總結(jié)與展望48-49
• 參考文獻(xiàn)49-54

【相似文獻(xiàn)】

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本文編號：320950