Toll樣受體家族可以識(shí)別幾乎所有的病原微生物的一些結(jié)構(gòu)組分和代謝產(chǎn)物,通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘發(fā)細(xì)胞因子和趨化因子等啟動(dòng)機(jī)體的天然免疫,構(gòu)成了機(jī)體抵抗病原微生物的第一道防線,在免疫學(xué)研究中一直是一個(gè)很受關(guān)注的家族。TLRs的活化是一把雙刃劍。一方面TLRs的活化在啟動(dòng)天然免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用,另外一方面過(guò)渡活化或者活化異常可能引起急慢性疾病。因此TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的負(fù)相調(diào)控成為天然免疫研究中的熱點(diǎn)問(wèn)題。目的:本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立穩(wěn)定表達(dá)Rab7及其突變體的巨噬細(xì)胞系,分析穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的生物學(xué)特性,研究Rab7及其突變體基因過(guò)表達(dá)后對(duì)LPS和Poly I:C刺激的巨噬細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子的影響。方法:將Rab7及其突變體Rab7（T22N）的真核表達(dá)載體通過(guò)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞,G418選擇性培養(yǎng)基篩選,建立穩(wěn)定表達(dá)Rab7及Rab7T22N的細(xì)胞系。通過(guò)RT-PCR和Western Blot方法鑒定穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。通過(guò)觀察細(xì)胞形態(tài)及MTT法分析穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的生長(zhǎng)特性。以LPS和Poly I:C刺激穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系不同時(shí)間后檢測(cè)細(xì)胞因子的表達(dá)量變化。結(jié)果:與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的... 

【文章來(lái)源】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)

【文章頁(yè)數(shù)】：47 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 Toll 家族背景介紹
        1.1.1 TLR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)
        1.1.2 TLR 信號(hào)與疾病的關(guān)系
        1.1.3 TLR3、TLR4 簡(jiǎn)介及關(guān)聯(lián)
        1.1.4 TLR3、4 配體介紹
    1.2 Rab 家族背景介紹
        1.2.1 Rab5、7、9 的簡(jiǎn)介
    1.3 研究意義
        1.3.1 Poly I:C/TLR3 信號(hào)通路過(guò)渡活化
        1.3.2 LPS/TLR4 信號(hào)通路過(guò)渡活化
        1.3.3 研究目的
2 Rab7 誘導(dǎo)表達(dá)模式的研究
    2.1 材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑
        2.1.2 儀器
        2.1.3 試劑配置
        2.1.4 引物
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 小鼠巨噬細(xì)胞株 RAW264.7 的培養(yǎng)
        2.2.2 細(xì)胞總 RNA 的提取及反轉(zhuǎn)錄
        2.2.3 cDNA 的制備
        2.2.4 PCR 反應(yīng)體系
        2.2.5 LPS 和poly I:C 刺激后 Rab5a、Rab7、Rab9 的mRNA 水平表達(dá)時(shí)效關(guān)系研究
    2.3 結(jié)果分析
        2.3.1 RAW 264.7 細(xì)胞的培養(yǎng)及刺激
        2.3.2 LPS 刺激 RAW264.7 細(xì)胞后 Rab5a、Rab7、Rab9 的mRNA 水平表達(dá)時(shí)-效關(guān)系研究
        2.3.3 Poly I:C 刺激 RAW264.7 細(xì)胞后 Rab5a、Rab7、Rab9 的mRNA 水平表達(dá)時(shí)-效關(guān)系研究
        2.3.4 RTQ-PCR 檢測(cè) Rab7 的mRNA 水平表達(dá)時(shí)效關(guān)系研究
    2.4 討論
3 Rab7 調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞 Toll 樣受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究
    3.1 材料與方法
        3.1.1 細(xì)胞株和主要試劑
        3.1.2 試劑配置
            3.1.2.1 配制聚丙烯酰電泳的試劑
            3.1.2.2 轉(zhuǎn)膜的試劑
        3.1.3 引物
        3.1.4 實(shí)驗(yàn)步驟
            3.1.4.1 RAW264.7 巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)
            3.1.4.2 細(xì)胞計(jì)數(shù)
            3.1.4.3 突變載體的構(gòu)建
            3.1.4.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
            3.1.4.5 蛋白提取
            3.1.4.6 BCA 檢測(cè)檢測(cè)蛋白濃度
            3.1.4.7 SDS-PAGE
            3.1.4.8 Western blotting
            3.1.4.9 NO、iNOS 含量測(cè)定
            3.1.4.10 MTT 法測(cè)基因轉(zhuǎn)染對(duì) RAW264.7 細(xì)胞的影響
    3.2 結(jié)果分析
        3.2.1 Rab7 突變體穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株的鑒定
        3.2.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞 RAW264.7 生長(zhǎng)形態(tài)
        3.2.3 Rab7 抑制 Poly I:C 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中 TNF-α、IL-1β的表達(dá)
        3.2.4 Rab7 抑制 Poly I:C 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中 IP-10、IFN-β的表達(dá)
        3.2.5 Poly I:C 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中 NO/iNOs 的表達(dá)
        3.2.6 Rab7 抑制 LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中 IP-10、IFN-β的表達(dá)
        3.2.7 Rab7 在 LPS 介導(dǎo)的 TLR4 通路中的作用
    3.3 討論
4 結(jié)論
5 展望
致謝
參考文獻(xiàn)
作者簡(jiǎn)介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3205722