Toll樣受體家族可以識別幾乎所有的病原微生物的一些結構組分和代謝產(chǎn)物,通過信號轉(zhuǎn)導通路誘發(fā)細胞因子和趨化因子等啟動機體的天然免疫,構成了機體抵抗病原微生物的第一道防線,在免疫學研究中一直是一個很受關注的家族。TLRs的活化是一把雙刃劍。一方面TLRs的活化在啟動天然免疫應答和適應性免疫應答中發(fā)揮重要作用,另外一方面過渡活化或者活化異�？赡芤鸺甭约膊�。因此TLR信號轉(zhuǎn)導通路的負相調(diào)控成為天然免疫研究中的熱點問題。目的:本實驗通過建立穩(wěn)定表達Rab7及其突變體的巨噬細胞系,分析穩(wěn)定表達細胞系的生物學特性,研究Rab7及其突變體基因過表達后對LPS和Poly I:C刺激的巨噬細胞表達細胞因子的影響。方法:將Rab7及其突變體Rab7（T22N）的真核表達載體通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞,G418選擇性培養(yǎng)基篩選,建立穩(wěn)定表達Rab7及Rab7T22N的細胞系。通過RT-PCR和Western Blot方法鑒定穩(wěn)定表達細胞系。通過觀察細胞形態(tài)及MTT法分析穩(wěn)定表達細胞系的生長特性。以LPS和Poly I:C刺激穩(wěn)定表達細胞系不同時間后檢測細胞因子的表達量變化。結果:與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學內(nèi)蒙古自治區(qū)

【文章頁數(shù)】：47 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 Toll 家族背景介紹
        1.1.1 TLR 信號轉(zhuǎn)導
        1.1.2 TLR 信號與疾病的關系
        1.1.3 TLR3、TLR4 簡介及關聯(lián)
        1.1.4 TLR3、4 配體介紹
    1.2 Rab 家族背景介紹
        1.2.1 Rab5、7、9 的簡介
    1.3 研究意義
        1.3.1 Poly I:C/TLR3 信號通路過渡活化
        1.3.2 LPS/TLR4 信號通路過渡活化
        1.3.3 研究目的
2 Rab7 誘導表達模式的研究
    2.1 材料
        2.1.1 實驗材料及試劑
        2.1.2 儀器
        2.1.3 試劑配置
        2.1.4 引物
    2.2 實驗方法
        2.2.1 小鼠巨噬細胞株 RAW264.7 的培養(yǎng)
        2.2.2 細胞總 RNA 的提取及反轉(zhuǎn)錄
        2.2.3 cDNA 的制備
        2.2.4 PCR 反應體系
        2.2.5 LPS 和poly I:C 刺激后 Rab5a、Rab7、Rab9 的mRNA 水平表達時效關系研究
    2.3 結果分析
        2.3.1 RAW 264.7 細胞的培養(yǎng)及刺激
        2.3.2 LPS 刺激 RAW264.7 細胞后 Rab5a、Rab7、Rab9 的mRNA 水平表達時-效關系研究
        2.3.3 Poly I:C 刺激 RAW264.7 細胞后 Rab5a、Rab7、Rab9 的mRNA 水平表達時-效關系研究
        2.3.4 RTQ-PCR 檢測 Rab7 的mRNA 水平表達時效關系研究
    2.4 討論
3 Rab7 調(diào)節(jié)巨噬細胞 Toll 樣受體信號轉(zhuǎn)導通路的研究
    3.1 材料與方法
        3.1.1 細胞株和主要試劑
        3.1.2 試劑配置
            3.1.2.1 配制聚丙烯酰電泳的試劑
            3.1.2.2 轉(zhuǎn)膜的試劑
        3.1.3 引物
        3.1.4 實驗步驟
            3.1.4.1 RAW264.7 巨噬細胞的培養(yǎng)
            3.1.4.2 細胞計數(shù)
            3.1.4.3 突變載體的構建
            3.1.4.4 細胞轉(zhuǎn)染
            3.1.4.5 蛋白提取
            3.1.4.6 BCA 檢測檢測蛋白濃度
            3.1.4.7 SDS-PAGE
            3.1.4.8 Western blotting
            3.1.4.9 NO、iNOS 含量測定
            3.1.4.10 MTT 法測基因轉(zhuǎn)染對 RAW264.7 細胞的影響
    3.2 結果分析
        3.2.1 Rab7 突變體穩(wěn)定表達的細胞株的鑒定
        3.2.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞 RAW264.7 生長形態(tài)
        3.2.3 Rab7 抑制 Poly I:C 誘導的巨噬細胞中 TNF-α、IL-1β的表達
        3.2.4 Rab7 抑制 Poly I:C 誘導的巨噬細胞中 IP-10、IFN-β的表達
        3.2.5 Poly I:C 誘導的巨噬細胞中 NO/iNOs 的表達
        3.2.6 Rab7 抑制 LPS 誘導的巨噬細胞中 IP-10、IFN-β的表達
        3.2.7 Rab7 在 LPS 介導的 TLR4 通路中的作用
    3.3 討論
4 結論
5 展望
致謝
參考文獻
作者簡介


【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3205722