本文關(guān)鍵詞：抗癌胚抗原（CEACAM 6）納米抗體的表達、純化及初步活性鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：納米抗體(Nanobody,Nb)即單域抗體(Variable domain of heavy chainof heavy-chain antibody,VHH),是駱駝科動物體內(nèi)天然存在的重鏈抗體的可變區(qū)域。納米抗體分子量小,大約15 KD左右,與傳統(tǒng)抗體的可變區(qū)相比有兩個顯著區(qū)別:納米抗體FR2區(qū)四個疏水性氨基酸突變?yōu)橛H水性氨基酸,增加了其在溶液中的溶解性;納米抗體CDR1和CDR3高變區(qū)比較長,分子內(nèi)部通過二硫鍵形成彎曲的長臂可以與靶點表面或者隱蔽的抗原結(jié)合位點結(jié)合,提高了納米抗體自身穩(wěn)定性以及與抗原的結(jié)合能力。納米抗體在許多領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用,例如在食品行業(yè)中可以中和毒素,檢測食品中微生物含量確保食品安全性等;在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究中,通過構(gòu)建單價或者多價納米抗體復(fù)合物,提高抗體與抗原的結(jié)合力,也可用有機染料或者生物標(biāo)記物修飾納米抗體用于分子成像,研究體內(nèi)外細胞結(jié)構(gòu)等;在疾病診斷方面,納米抗體可以鑒別臨床樣本中病原微生物的種類;在腫瘤靶向治療方面,將治療性藥物與納米抗體共載,提高腫瘤靶向治療的效果等。由于腫瘤標(biāo)志物在腫瘤的診斷和治療當(dāng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,因此高特異性、專一性好的腫瘤標(biāo)志物的篩選是亟待解決的難題。隨著納米抗體的發(fā)現(xiàn)和研究,在臨床樣本中應(yīng)用納米抗體篩選和檢測腫瘤標(biāo)志物為腫瘤早期診斷提供了便利,因此納米抗體的發(fā)展和應(yīng)用在腫瘤標(biāo)志物的篩選以及腫瘤的抗體靶向治療藥物研發(fā)過程中具有巨大潛力。隨著基因工程的發(fā)展,利用不同的宿主,使得目的蛋白的大量生產(chǎn)成為可能。人們可以根據(jù)自己的意愿設(shè)計改造目的蛋白的基因序列,與具有不同功能的表達載體構(gòu)建在一起,轉(zhuǎn)化到宿主體內(nèi)后進行發(fā)酵生產(chǎn),例如原核表達系統(tǒng)(大腸桿菌,Escherichia Coli)、真核表達系統(tǒng)(巴斯德畢赤酵母酵母,Pichia pastoris和釀酒酵母,Cerevisiae)等。原核表達系統(tǒng)具有操作簡單、成本低廉、基因背景影響較低、外源蛋白表達量高等特點,適合納米抗體這種結(jié)構(gòu)簡單的小分子蛋白的生產(chǎn)。本實驗將從羊駝納米抗體庫內(nèi)篩選出的三種不同親和力的抗CEACAM 6納米抗體(Nb15、Nb35和Nb37),并將含有納米抗體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到TG1大腸桿菌中,并利用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達。分別對誘導(dǎo)表達所需的誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時間進行優(yōu)化,確立了納米抗體最適誘導(dǎo)表達條件;利用鎳柱進行親和層析,篩選最適咪唑洗脫濃度并進行大量純化,獲得較高純度和濃度的納米抗體蛋白樣品;經(jīng)過PBS透析除鹽,利用流式細胞術(shù)檢測不同腫瘤細胞表面CEACAM 6抗原含量,驗證納米抗體與腫瘤細胞表面抗原的結(jié)合活性,篩選確定人乳腺癌細胞MCF-7為CEACAM 6高表達細胞株;接著利用MCF-7腫瘤細胞篩選確定親和力最優(yōu)納米抗體為Nb15-2;最后將納米抗體Nb15-2逐步進行弱陰離子交換層析與親和層析進行提純優(yōu)化,得到純度為99.6%的納米抗體蛋白,有效的提高了納米抗體蛋白的純度。為納米抗體工業(yè)化生產(chǎn)、疾病診斷與腫瘤靶向治療的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：納米抗體 表達 純化 腫瘤標(biāo)志物 靶向治療
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q78;R392
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstarct6-12
• 第一章 前言12-21
• 1.1 納米抗體的簡介12-18
• 1.1.1 抗體的發(fā)展12-14
• 1.1.2 納米抗體的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)特性14-16
• 1.1.3 納米抗體的應(yīng)用16-18
• 1.2 癌胚抗原18-21
• 1.2.1 腫瘤標(biāo)志物18
• 1.2.2 CEACAM 618-21
• 第二章 材料與方法21-39
• 2.1 主要材料試劑及實驗設(shè)備21-25
• 2.1.1 菌株和質(zhì)粒21
• 2.1.2 儀器與設(shè)備21-22
• 2.1.3 實驗材料及試劑22-23
• 2.1.4 常用溶液的配制23-25
• 2.2 三種納米抗體的誘導(dǎo)表達25-30
• 2.2.1 納米抗體原核表達菌株的鑒定25-28
• 2.2.2 三種納米抗體高表達菌株的篩選28-29
• 2.2.3 Nb15-2、Nb35-2 和Nb37-1 誘導(dǎo)表達條件優(yōu)化29-30
• 2.3 Nb15-2、Nb35-2 和Nb37-1 的純化30-35
• 2.3.1 Nb15-2、Nb35-2 和Nb37-1 可溶性驗證30-32
• 2.3.2 Nb15-2、Nb35-2 和Nb37-1 純化條件篩選32-34
• 2.3.3 Nb15-2、Nb35-2 和Nb37-1 大量純化34-35
• 2.4 納米抗體初步活性研究35-39
• 2.4.1 流式細胞術(shù)篩選CEACAM 6 高表達腫瘤細胞株35-37
• 2.4.2 納米抗體親和力分析37
• 2.4.3 納米抗體Nb15-2 的提純優(yōu)化37-39
• 第三章 實驗結(jié)果39-53
• 3.1 納米抗體陽性表達菌株的鑒定39-40
• 3.1.1 pSJF2-15、pSJF2-35和pSJF2-37質(zhì)粒雙酶切39
• 3.1.2 pSJF2-15、pSJF2-35和pSJF2-37序列比對39-40
• 3.2 三種納米抗體誘導(dǎo)表達40-45
• 3.2.1 IPTG小量快速誘導(dǎo)表達40-41
• 3.2.2 誘導(dǎo)表達條件優(yōu)化41-45
• 3.3 納米抗體的純化45-49
• 3.3.1 納米抗體誘導(dǎo)表達可溶性分析45-46
• 3.3.2 納米抗體誘導(dǎo)表達蛋白Western blot驗證46
• 3.3.3 納米抗體親和層析條件篩選46-48
• 3.3.4 納米抗體大量純化48
• 3.3.5 大量純化的納米抗體蛋白Western blot驗證48-49
• 3.3.6 蛋白濃度測定49
• 3.4 納米抗體的初步活性分析49-53
• 3.4.1 CEACAM 6 高表達腫瘤細胞的篩選49-50
• 3.4.2 納米抗體親和力分析50-52
• 3.4.3 納米抗體Nb15-2 的提純優(yōu)化52-53
• 第四章 討論53-55
• 第五章 結(jié)論55-56
• 第六章 參考文獻56-60
• 第七章 致謝60

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 李策;聶彩輝;張力君;徐寒梅;;腫瘤標(biāo)志物的應(yīng)用及其篩選技術(shù)研究進展[J];藥學(xué)進展;2014年01期

2 劉萍;陳苗苗;劉學(xué)榮;牟克斌;黃銀君;;單克隆抗體研究進展[J];中國畜牧獸醫(yī);2012年01期

3 賀曉旭;徐濟責(zé);;抗體工程的研究進展[J];現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué);2009年04期

4 胡春艷;劉全忠;;單克隆抗體制備技術(shù)及應(yīng)用的研究進展[J];安徽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2008年02期

5 王秀紅;周素芳;;基因工程抗體研究進展[J];生物技術(shù)通訊;2007年02期

6 李昌龍;基因工程抗體的研究進展[J];國外醫(yī)學(xué).臨床生物化學(xué)與檢驗學(xué)分冊;1995年01期

  本文關(guān)鍵詞：抗癌胚抗原（CEACAM 6）納米抗體的表達、純化及初步活性鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：316670