本文關(guān)鍵詞：基于流感HA2的重組NoV P-particle免疫原性和保護(hù)性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：流感病毒嚴(yán)重影響人類(lèi)健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展,每年都會(huì)出現(xiàn)大量的患病和死亡病例。盡管過(guò)去的十年里,抗病毒治療已經(jīng)取得較好的發(fā)展,免疫仍然是預(yù)防和控制流感的最有效的措施。由于病毒HA1蛋白的高突變性,使得針對(duì)病毒“頭部”區(qū)的廣譜疫苗設(shè)計(jì)變得很困難。研究表明,流感病毒HA2蛋白相對(duì)保守,其結(jié)構(gòu)變化在病毒感染宿主細(xì)胞的過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用,成為許多流感病毒廣譜中和抗體的作用靶點(diǎn),因此是流感通用型疫苗的研究熱點(diǎn)。流感病毒HA前體蛋白HA0在宿主蛋白酶的作用下裂解產(chǎn)生HA1和HA2蛋白,對(duì)于膜融合是必不可少的過(guò)程。HA1與宿主細(xì)胞受體結(jié)合,經(jīng)過(guò)內(nèi)吞過(guò)程,在內(nèi)涵體低p H(5-6)條件下,HA2會(huì)發(fā)生一系列的構(gòu)象變化,在融合前狀態(tài)下隱藏的流感表位會(huì)發(fā)生短暫的暴露,被免疫系統(tǒng)所識(shí)別,產(chǎn)生免疫應(yīng)答。但是由于隱藏的表位暴露時(shí)間短,免疫應(yīng)答較弱。針對(duì)HA2的保守區(qū)設(shè)計(jì)能夠產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答的流感表位是本論文研究的重點(diǎn)。研究表明No V P蛋白有三個(gè)突出的loops,可以插入外源表位,呈遞抗原。E.coli表達(dá)的No V P重組蛋白能夠自發(fā)形成直徑約20nm的二十四聚體P-particle,增強(qiáng)免疫原性。我們分析了17524株H1,10763株H3,4022株B型流感HA2保守性,結(jié)合表位預(yù)測(cè)網(wǎng)站進(jìn)行預(yù)測(cè),篩選出三條可能產(chǎn)生較強(qiáng)免疫應(yīng)答的HA2型表位H1:DIWTYNAELLVLLENE,H3:DLWSYNAELLVALENQ,B:TISSQIELAVLLSNE C。將三條設(shè)計(jì)表位單獨(dú)和共同插入No V P蛋白的三個(gè)loops上,表位和loop之間用GGGGS作為linker,便于將表位突出暴露在病毒P-particle外,通過(guò)原核表達(dá)得到四種嵌合流感表位的No V P-particle:PP-H1,PP-H3,PP-B,PP-H1-H3-B,經(jīng)過(guò)粒徑分析,電鏡觀察進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征,然后免疫,期望獲得針對(duì)流感病毒HA2的廣譜中和抗體。BALB/c雌鼠免疫四次,間隔兩周,評(píng)價(jià)重組蛋白免疫原性。結(jié)果表明免疫血清針對(duì)H1,H3,B型流感HA2表位特異性抗體效價(jià)分別為1.25*105,1.17*105和7.03*104。PP-H1-H3-B免疫血清針對(duì)H1,H3,B表位抗體效價(jià)分別為:1.15*105,9.91*104和2.25*104。交叉結(jié)合活性研究發(fā)現(xiàn),免疫血清均能與另外兩種表位結(jié)合。PP-H1免疫血清針對(duì)H3和B表位的抗體效價(jià)為:1.11*105和3.14*103,PP-H3免疫血清針對(duì)H1和B表位的抗體效價(jià)為:1.16*105和3.26*103,PP-B免疫血清針對(duì)H1和H3表位的抗體效價(jià)為:1.59*104和1.32*104,這種交叉結(jié)合間接證明了我們?cè)O(shè)計(jì)的流感表位的通用性。由于篩選的表位位于病毒HA2,免疫血清不會(huì)有血凝抑制現(xiàn)象,與血凝抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致�？贵w分型發(fā)現(xiàn),免疫血清中Ig M和Ig G1有顯著提升,重組蛋白誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)主要是體液免疫,伴有較弱的細(xì)胞免疫。體外微中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重組蛋白免疫血清對(duì)兩株H3亞型病毒均有明顯的中和活性,PP-H1組對(duì)兩株H3亞型病毒ID50分別是614.0,1113。PP-H3組對(duì)兩株H3亞型病毒ID50分別是908.2,1592.8。PP-B組對(duì)兩株H3亞型病毒ID50分別是410.9,653.2。PP-H1-H3-B組對(duì)H3亞型病毒ID50分別是1438.2,523.2。小鼠免疫PP-H1-H3-B后,采用H3亞型病毒進(jìn)行攻毒。3天后取肺組織檢測(cè)肺部病毒拷貝數(shù)為103.157-3.17,與PBS對(duì)照組(103.77-3.79)比較存在顯著性差異。結(jié)果表明PP-H1-H3-B免疫后能夠有效抑制病毒在小鼠肺部復(fù)制,降低肺部病毒載量。綜上,PP-epitopes主要是針對(duì)流感病毒HA2蛋白在病毒感染宿主細(xì)胞過(guò)程中構(gòu)象變化特點(diǎn)以及HA2蛋白保守性而設(shè)計(jì)的,免疫血清與表位有交叉結(jié)合性,四種重組蛋白免疫血清對(duì)兩株H3亞型病毒具有中和活性,為通用型流感疫苗的研發(fā)提供了一定的基礎(chǔ)。但是病毒免疫原的設(shè)計(jì)要綜合考慮體液免疫和細(xì)胞免疫,平衡兩者的比重。PP-epitopes在流感病毒疫苗應(yīng)用中不僅能夠降低研發(fā)成本,而且能夠縮短研發(fā)周期,有效的應(yīng)對(duì)流感大爆發(fā)。
【關(guān)鍵詞】：流感病毒HA2 表位 廣譜中和抗體 P-particle 抗體效價(jià)
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R373.13
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 縮略詞表9-13
• 第一部分 緒論13-25
• 1.1 流感病毒簡(jiǎn)介13-16
• 1.1.1 流行性感冒13-14
• 1.1.2 流感病毒結(jié)構(gòu)特點(diǎn)14
• 1.1.3 流感病毒的分型14-15
• 1.1.4 流感病毒HA蛋白15-16
• 1.2 流感病毒的感染機(jī)制16-17
• 1.3 流感病毒的預(yù)防與治療手段17-21
• 1.3.1 抗病毒藥物18-19
• 1.3.2 滅活病毒疫苗19
• 1.3.3 減毒活疫苗19-20
• 1.3.4 DNA疫苗20
• 1.3.5 基于HA2的新型通用保護(hù)性疫苗20-21
• 1.4 諾如病毒(NoV) P-particle21-23
• 1.4.1 NoV結(jié)構(gòu)特點(diǎn)21-22
• 1.4.2 NoV P-particle呈遞抗原22-23
• 1.5 本課題的立題依據(jù)及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)23-25
• 1.5.1 立題依據(jù)23-24
• 1.5.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)24-25
• 第二部分 實(shí)驗(yàn)材料與方法25-46
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料25-36
• 2.1.1 基因合成25-29
• 2.1.2 主要試劑29-31
• 2.1.3 主要儀器31-32
• 2.1.4 質(zhì)粒，菌種和細(xì)胞32
• 2.1.5 試劑配制32-35
• 2.1.6 細(xì)胞系，病毒，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物35-36
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法36-46
• 2.2.1 流感表位的篩選36
• 2.2.2 pET-28a-PP-epitope嵌合質(zhì)粒的構(gòu)建36-38
• 2.2.3 重組蛋白表達(dá)，，包涵體檢測(cè)38-39
• 2.2.4 蛋白純化及蛋白透析復(fù)性39-40
• 2.2.5 蛋白性質(zhì)分析40-41
• 2.2.6 動(dòng)物免疫41
• 2.2.7 免疫效果評(píng)價(jià)41-46
• 第三部分 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析46-63
• 3.1 流感表位的篩選46-51
• 3.2 pET-28a-PP-epitope嵌合質(zhì)粒的構(gòu)建51
• 3.3 重組蛋白表達(dá)，包涵體檢測(cè)及純化51-54
• 3.4 重組蛋白結(jié)構(gòu)表征54-55
• 3.5 免疫效果評(píng)價(jià)55-62
• 3.5.1 抗血清和表位結(jié)合性測(cè)定55-58
• 3.5.2 血凝和血凝抑制實(shí)驗(yàn)58-59
• 3.5.3 抗體分型檢測(cè)59-60
• 3.5.4 抗體中和能力測(cè)定60-62
• 3.6 攻毒效果評(píng)價(jià)62-63
• 討論63-65
• 結(jié)論65-66
• 參考文獻(xiàn)66-74
• 作者簡(jiǎn)介74-75
• 致謝75

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 孫向彬;制備高效價(jià)細(xì)菌免疫血清應(yīng)重視的幾個(gè)因素[J];農(nóng)墾醫(yī)學(xué);2005年03期

2 宋殿森;程松高;;變形h菌免疫血清的抗蔓延生長(zhǎng)的作用[J];微生物學(xué)報(bào);1959年04期

3 方丁;王慧芬;蘇美];;免疫血清對(duì)吞噬、殺菌與細(xì)胞代謝的影響[J];科學(xué)通報(bào);1965年09期

4 丁文山;;免疫血清學(xué)在昆蟲(chóng)學(xué)上的利用試驗(yàn)簡(jiǎn)報(bào)[J];河南農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào);1980年01期

5 戚景彝;戚迦陵;劉雋湘;;流行性乙型腦炎病毒免疫血清的制造與檢定[J];微生物學(xué)報(bào);1953年02期

6 T3安然;;流行性乙型乫炎補(bǔ)體}P合奻歐與血球凝集抑制奻歐的比

本文編號(hào)：311760