本文關(guān)鍵詞：miR-21體外轉(zhuǎn)染神經(jīng)元方案優(yōu)化及其在體外TBI模型中神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:本研究首先通過(guò)在不同轉(zhuǎn)染條件下,包括不同的轉(zhuǎn)染溶劑、預(yù)處理和轉(zhuǎn)染試劑濃度,對(duì)miR-21在神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)水平和神經(jīng)元損傷的檢測(cè),建立一種穩(wěn)定、高效,并且對(duì)神經(jīng)元損傷較小的轉(zhuǎn)染方案。進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)染體外神經(jīng)元,并通過(guò)TBI模型來(lái)檢測(cè)miR-21在TBI過(guò)程中是否發(fā)揮抗凋亡作用并探索其可能的作用機(jī)制,為進(jìn)一步的研究和顱腦創(chuàng)傷的臨床基因治療提供理論依據(jù)方法:神經(jīng)元取自24小時(shí)的Wistar乳鼠,培養(yǎng)7天。標(biāo)記FAM的miR-21Agomior用于檢測(cè)miR-21是否可以轉(zhuǎn)染進(jìn)入神經(jīng)元。神經(jīng)元隨機(jī)分為5組:饑餓-DMEM(S-DMEM)組、非饑餓-DMEM(N-DMEM)組、饑餓-Neurobasal(S-Neurobasal)組和非饑餓-Neurobasal(N-Neurobasal)組和空白對(duì)照組(Sham)。miR-21 oligomers(20μM,2.5μl)與RNAiMAX(0.5/1/1.5/2/2.5μl)融合后,加入DMEM或Neurobasal-A使轉(zhuǎn)染液達(dá)到500μl或250μl。饑餓組在轉(zhuǎn)染前,僅加入250μlDMEM或Neurobasal行饑餓1小時(shí)。然后將轉(zhuǎn)染液加入各組的到6孔板中轉(zhuǎn)染6小時(shí),繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)進(jìn)行下一步的試驗(yàn)分析。mi R-21在神經(jīng)元內(nèi)的表達(dá)通過(guò)RT-PCR及miR-21靶基因PTEN和PDCD4的表達(dá)情況來(lái)檢測(cè)。同時(shí)為了避免miR-21的生物學(xué)作用對(duì)神經(jīng)元損傷的影響,將miR-21 agomir更換為miR-21 negative control后,進(jìn)行轉(zhuǎn)染后,通過(guò)TUNEL凋亡試劑盒和MTT試驗(yàn)檢測(cè)神經(jīng)元損傷情況。按照上述轉(zhuǎn)染方案,將FAM標(biāo)記的miR-21 agomir用于檢測(cè)miR-21的轉(zhuǎn)染效率。然后將細(xì)胞隨機(jī)分為5組:空白組,TBI組,TBI+miR-21agomir(TBI-A)組,TBI+miR-21 antagomir(TBI-AN)組和TBI+miR-21 negative control(TBI-NC)組。mi R-21 agomir,miR-21 antagomir和mi R-21 negative control按相應(yīng)組進(jìn)行轉(zhuǎn)染;轉(zhuǎn)染后48小時(shí),除空白組外,分別進(jìn)行劃痕損傷。劃痕損傷后24小時(shí),各組神經(jīng)元內(nèi)miR-21和PTEN表示水平通過(guò)RT-PCT檢測(cè);各組神經(jīng)元的凋亡情況通過(guò)TUNEL和MAP-2熒光雙染檢測(cè)。Western Blot檢測(cè)PTEN、總AKT、p-AKT,以及其下游凋亡相關(guān)蛋白caspase-9、cleavaged caspase-3、Bcl-2和Bax的表達(dá)情況。結(jié)果:FAM-miR-21可以轉(zhuǎn)染進(jìn)入神經(jīng)元。miR-21在Neurobasal組中比DMEM組中表達(dá)明顯升高,同時(shí)RANiMAX在1.5μl時(shí),miR-21的表達(dá)水平達(dá)到最高峰,繼續(xù)增加RANiMAX劑量沒(méi)有增高miR-21的表達(dá)水平。同時(shí)神經(jīng)元損傷具有條件依賴性和劑量依賴性,饑餓組凋亡細(xì)胞相對(duì)于非饑餓組明顯增加,同時(shí)相對(duì)于RNAiMAX:miR-21=4/5:5,RNAiMAX:mi R-21=1/2/3:5的凋亡神經(jīng)元明顯減少。隨后的試驗(yàn)證明,劃痕損傷的神經(jīng)元引起TBI中相似的凋亡情況,并且miR-21 agomir/antagomir可以上調(diào)/下調(diào)神經(jīng)元中miR-21的表示水平。同時(shí),TUNEL結(jié)果顯示:miR-21減少TBI損傷中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞。對(duì)PTEN-AKT通路檢測(cè)發(fā)現(xiàn):miR-21降低PTEN的基因表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平,并且使p-KAT表達(dá)水平升高。Western Blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白結(jié)果顯示:mi R-21減少caspase-9、cleavaged caspase-3和Bcl-2表達(dá),而增加Bax在神經(jīng)元中的表達(dá)。結(jié)論:miR-21轉(zhuǎn)染神經(jīng)元的方案是以Neurobasal-A為溶劑,不經(jīng)過(guò)饑餓處理,在miR-21 agomir:RNAiMAX=3:5的比例下進(jìn)行轉(zhuǎn)染;同時(shí)通過(guò)上調(diào)或者下調(diào)神經(jīng)元中miR-21表示水平發(fā)現(xiàn),miR-21可以減少體外TBI模型中神經(jīng)元的凋亡,同時(shí)研究發(fā)現(xiàn),miR-21是通過(guò)作用于PTEN-AKT通路,調(diào)節(jié)下游相關(guān)凋亡蛋白caspase-9、cleavaged caspase-3、Bcl-2和Bax的表達(dá)水平來(lái)發(fā)揮作用的。
【關(guān)鍵詞】：顱腦損傷 mi R-21 神經(jīng)元 轉(zhuǎn)染 lipofectamine RNAiMAX 凋亡 PTEN-AKT 通路
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R651.15;R-332
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 縮略語(yǔ)/符號(hào)說(shuō)明10-12
• 前言12-15
• 研究現(xiàn)狀、成果12-13
• 研究目的、方法13-15
• 一、神經(jīng)元提取和miR-21轉(zhuǎn)染神經(jīng)元方案優(yōu)化15-35
• 1.1 對(duì)象和方法15-28
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物15
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器15-16
• 1.1.3 試劑和耗材16-17
• 1.1.4 主要試劑、液體的配制17-18
• 1.1.5 實(shí)驗(yàn)方法18-28
• 1.2 結(jié)果28-33
• 1.2.1 神經(jīng)元的分離培養(yǎng)28-29
• 1.2.2 FAM-miR-21轉(zhuǎn)染神經(jīng)元和MAP-2 染色29-30
• 1.2.3 轉(zhuǎn)染后神經(jīng)元內(nèi)miR-21的表達(dá)30-31
• 1.2.4 轉(zhuǎn)染后神經(jīng)元內(nèi)miR-21靶基因PTEN和PDCD4的表達(dá)31
• 1.2.5 轉(zhuǎn)染后神經(jīng)元的凋亡31-33
• 1.2.6 神經(jīng)元轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞活性33
• 1.3 討論33-34
• 1.4 小結(jié)34-35
• 二、miR-21抑制體外TBI模型中神經(jīng)元凋亡的現(xiàn)象觀察35-44
• 2.1 對(duì)象和方法35-40
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物35
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器35-36
• 2.1.3 試劑和耗材36
• 2.1.4 主要試劑、液體的配制36
• 2.1.5 實(shí)驗(yàn)方法36-40
• 2.2 結(jié)果40-43
• 2.2.1 mi R-21在神經(jīng)元內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)水平變化40-41
• 2.2.2 miR-21抑制TBI損傷后神經(jīng)元的凋亡41-43
• 2.3 討論43
• 2.4 小結(jié)43-44
• 三、miR-21通過(guò)PTEN-AKT通路抑制體外TBI模型中神經(jīng)元的凋亡44-54
• 3.1 對(duì)象和方法44-48
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物44
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器44
• 3.1.3 試劑和耗材44-45
• 3.1.4 主要試劑、液體的配制45
• 3.1.5 實(shí)驗(yàn)方法45-48
• 3.2 結(jié)果48-52
• 3.2.1 miR-21抑制PTEN蛋白質(zhì)水平的表達(dá)48-49
• 3.2.2 miR-21通過(guò)抑制PTEN表達(dá)來(lái)減少p-Akt的表達(dá)49-50
• 3.2.3 miR-21通過(guò)作用于PTEN-Akt通路來(lái)調(diào)節(jié)下游的凋亡相關(guān)蛋白50-52
• 3.3 討論52-53
• 3.4 小結(jié)53-54
• 結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-59
• 發(fā)表論文和參加科研情況說(shuō)明59-60
• 附錄60-61
• 綜述 miR-21在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中作用的研究進(jìn)展61-70
• 綜述參考文獻(xiàn)67-70
• 致謝70

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 孫婷怡;陳曉瑞;劉子龍;趙麗麗;江永祥;屈國(guó)強(qiáng);王榮帥;黃鍶哲;劉良;;Expression Profiling of MicroRNAs in Hippocampus of Rats Following Traumatic Brain Injury[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2014年04期

  本文關(guān)鍵詞：miR-21體外轉(zhuǎn)染神經(jīng)元方案優(yōu)化及其在體外TBI模型中神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：310417