發(fā)布時(shí)間：2017-04-16 02:23

  本文關(guān)鍵詞：HIPK2調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞增殖與凋亡的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：前言:哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育是一個(gè)多步驟、復(fù)雜的漸進(jìn)過(guò)程,其中神經(jīng)干細(xì)胞作為整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中各種類型神經(jīng)細(xì)胞的唯一來(lái)源,在大腦結(jié)構(gòu)形成和神經(jīng)功能完整性的建立中占據(jù)重要的地位。既往研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)干細(xì)胞增殖、自我更新及分化過(guò)程中,Notch信號(hào)通路發(fā)揮重要作用,然而其具體機(jī)制尚未完全闡明。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白激酶2(HIPK2)可能與Notch信號(hào)通路相互作用參與調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞分化過(guò)程。本課題組前期對(duì)小鼠腦組織中Notch信號(hào)下游關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RBP-J進(jìn)行特異性敲除,通過(guò)基因芯片檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn):在特異性阻斷Notch信號(hào)通路后,Hipk2表達(dá)下調(diào)。由此我們推測(cè)Hipk2可能在Notch信號(hào)的調(diào)節(jié)下發(fā)揮調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化及凋亡的作用。本研究擬運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)體系和研究方法,探索Hipk2對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖及凋亡的影響及Notch信號(hào)對(duì)Hipk2的調(diào)控作用,為進(jìn)一步揭示神經(jīng)干細(xì)胞增殖、自我更新及分化機(jī)制開(kāi)辟新的視角。實(shí)驗(yàn)方法:(1)利用實(shí)時(shí)定量PCR方法,檢測(cè)神經(jīng)干/祖細(xì)胞系(C17.2細(xì)胞)、原代神經(jīng)干細(xì)胞及原代神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化7天后細(xì)胞內(nèi)Hipk2的表達(dá)。運(yùn)用原位雜交實(shí)驗(yàn),觀察胚胎12.5及14.5天胎鼠大腦組織和視網(wǎng)組織中Hipk2的表達(dá)。(2)運(yùn)用分子克隆技術(shù),構(gòu)建PCAG-Hipk2-IRES-EGFP質(zhì)粒,并通過(guò)菌液PCR反應(yīng)和雙酶切反應(yīng)對(duì)構(gòu)建質(zhì)粒進(jìn)行鑒定后公司測(cè)序。在此基礎(chǔ)上運(yùn)用細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù),將Hipk2表達(dá)質(zhì)粒(PCAG-Hipk2-IRES-EGFP)和載體質(zhì)粒(PCAG-IRESEGFP)分別轉(zhuǎn)染入C17.2細(xì)胞過(guò)表達(dá)48小時(shí)后,采用MTT比色法、流式細(xì)胞周期檢測(cè)技術(shù)、細(xì)胞Ki67免疫熒光染色及細(xì)胞Edu摻入實(shí)驗(yàn),檢測(cè)Hipk2對(duì)C17.2細(xì)胞增殖的影響,并通過(guò)細(xì)胞流式凋亡檢測(cè)技術(shù)和Western blot技術(shù),檢測(cè)Hipk2對(duì)C17.2細(xì)胞凋亡的影響。(3)利用實(shí)時(shí)定量PCR方法和Western blot技術(shù),分別檢測(cè)25μM和75μM Notch抑制劑GSI干預(yù)C17.2細(xì)胞24小時(shí)和48小時(shí)后細(xì)胞內(nèi)Hipk2的表達(dá)。利用TRANSFAC,NCBI,promoter scan等軟件分析Hipk2啟動(dòng)子中可能存在的Notch信號(hào)作用位點(diǎn)(如RBP-J、Hes等)。為明確Notch信號(hào)通路對(duì)Hipk2的調(diào)節(jié)作用,運(yùn)用分子克隆技術(shù),構(gòu)建PGL3-Basic-Hipk2-promoter質(zhì)粒,并通過(guò)菌液PCR反應(yīng)和雙酶切反應(yīng)對(duì)構(gòu)建質(zhì)粒進(jìn)行鑒定后公司測(cè)序。在此基礎(chǔ)上利用細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù),將PGL3-Basic-Hipk2-promoter質(zhì)粒和內(nèi)參質(zhì)粒p RL-TK分別轉(zhuǎn)染至神經(jīng)干/前體細(xì)胞系(C17.2細(xì)胞),小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系(HT-22細(xì)胞),人腎上皮細(xì)胞系(293T細(xì)胞),小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系(3T3細(xì)胞),通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)不同細(xì)胞中Hipk2的螢光素酶活性。進(jìn)一步利用細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù),將PCAG-NICDGFP質(zhì)粒、PGL3-Basic-Hipk2-promoter質(zhì)粒、內(nèi)參質(zhì)粒p RL-TK、工具質(zhì)粒PCAG-GFP共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞和C17.2細(xì)胞,檢測(cè)兩種細(xì)胞中Notch受體胞內(nèi)段(NICD)作用后Hipk2的熒光素酶活性,并運(yùn)用同樣的實(shí)驗(yàn)方案和方法分別檢測(cè)Notch通路關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RBP-J、Notch下游基因Hes1作用后Hipk2的熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),神經(jīng)干/祖細(xì)胞系(C17.2細(xì)胞)、原代神經(jīng)干細(xì)胞及原代神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化7天后細(xì)胞內(nèi)均存在Hipk2的表達(dá)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)與原代神經(jīng)干細(xì)胞相比,Hipk2在原代神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化7天后表達(dá)降低。胎鼠大腦及視網(wǎng)膜原位雜交結(jié)果顯示,Hipk2廣泛表達(dá)于胎鼠大腦和視網(wǎng)膜組織,且在大腦腦室下帶以及視網(wǎng)膜成神經(jīng)細(xì)胞層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層中表達(dá)較強(qiáng)。(2)運(yùn)用分子克隆技術(shù)成功構(gòu)建Hipk2表達(dá)序列質(zhì)粒(PCAG-Hipk2-IRESEGFP)后,MTT、流式細(xì)胞周期檢測(cè)以及細(xì)胞Ki67免疫熒光染色及細(xì)胞Edu摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果均顯示,與載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比,Hipk2過(guò)表達(dá)后能夠抑制C17.2細(xì)胞增殖。流式凋亡檢測(cè)和活化caspase-3及Bcl-2蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果顯示Hipk2能夠促進(jìn)C17.2細(xì)胞凋亡。(3)實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組(DMSO干預(yù))相比,GSI干預(yù)組細(xì)胞中Hipk2在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)均降低。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件TRANSFAC,NCBI及promoter scan等綜合分析Hipk2啟動(dòng)子序列后,結(jié)果顯示Hipk2啟動(dòng)子區(qū)存在2個(gè)RBP-J結(jié)合位點(diǎn)(GTGGGAA、TTCCCAC),9個(gè)Hes1結(jié)合位點(diǎn)即N-box位點(diǎn)(CACNAG)。運(yùn)用分子克隆技術(shù)成功構(gòu)建PGL3-Basic-Hipk2-promoter質(zhì)粒后,雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示在HT-22細(xì)胞、3T3細(xì)胞、293T細(xì)胞及C17.2細(xì)胞中Hipk2的表達(dá)存在差異,為此我們選取Hipk2表達(dá)較高的293T細(xì)胞和表達(dá)較高且具有神經(jīng)特異性的C17.2細(xì)胞作為我們下述研究的細(xì)胞基礎(chǔ)。運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分別檢測(cè)NICD、RBP-J、Hes1對(duì)Hipk2啟動(dòng)子調(diào)節(jié)作用的結(jié)果顯示,NICD和RBP-J均能作用于Hipk2,激活其啟動(dòng)子的表達(dá)。在293T細(xì)胞中Hes1能較強(qiáng)的抑制Hipk2啟動(dòng)子的表達(dá),使其表達(dá)降低,然而在C17.2細(xì)胞中這種抑制作用并不明顯。結(jié)論:(1)Hipk2在神經(jīng)干/祖細(xì)胞系和原代神經(jīng)干細(xì)胞及胎鼠大腦、視網(wǎng)膜中均高表達(dá)。(2)體外過(guò)表達(dá)Hipk2能抑制神經(jīng)干/前體細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡。(3)初步證實(shí)Notch信號(hào)通路中關(guān)鍵分子NICD、RBP-J對(duì)Hipk2啟動(dòng)子表達(dá)具有顯著的調(diào)控作用。
【關(guān)鍵詞】：同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白激酶2 神經(jīng)干細(xì)胞 Notch信號(hào)通路 增殖 凋亡
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R338
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-14
• 文獻(xiàn)回顧14-25
• 實(shí)驗(yàn)一Hipk2 在神經(jīng)干細(xì)胞及胚胎大腦視網(wǎng)膜組織中的表達(dá)25-35
• 1 材料25-26
• 2 方法26-31
• 3 結(jié)果31-33
• 4 討論33-35
• 實(shí)驗(yàn)二HIPK2 對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)作用35-48
• 1 材料35-36
• 2 方法36-40
• 3 結(jié)果40-46
• 4 討論46-48
• 實(shí)驗(yàn)三Notch信號(hào)通路對(duì)Hipk2 表達(dá)調(diào)控作用48-63
• 1 材料48-49
• 2 方法49-57
• 3 結(jié)果57-61
• 4 討論61-63
• 小結(jié)63-64
• 參考文獻(xiàn)64-71
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果71-72
• 致謝72

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 劉福學(xué);夏青生;邱杰;劉曉露;李圓;;C-myb和p53在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及臨床意義[J];腫瘤學(xué)雜志;2015年04期

  本文關(guān)鍵詞：HIPK2調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞增殖與凋亡的作用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：309808