發(fā)布時間：2017-04-15 12:05

  本文關鍵詞：金黃色葡萄球菌非蛋白成分PGN模擬肽保護性作用機制研究及LTA模擬肽初步篩選和鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S. aureus)屬于革蘭氏陽性菌,不但能夠引起皮膚和軟組織感染,嚴重者可引起威脅生命的菌血癥、肺炎、骨髓炎、腦膜炎及膿毒血癥。自1961年Jevons等發(fā)現世界上第1例耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aures,MRS A)以來,新的耐藥株不斷出現并在世界范圍內造成感染的流行,而近年來抗生素的濫用導致細菌耐藥程度進一步加重,因此,免疫學防治手段被寄予希望�，F階段針對金葡菌不同成分如細菌表面蛋白、莢膜多糖交聯(lián)蛋白成分或毒素等致病因子的10余種疫苗尚無一被批準用于臨床。S. aureus疫苗研發(fā)的難點主要有：①致病因子眾多,不同致病因子在感染不同時期表達,單一成分的疫苗效果不佳；②金葡菌可逃避免疫系統(tǒng)對其殺傷；③單純誘導體液免疫應答的疫苗只能降低動物模型感染的嚴重程度,而無法阻止二次感染,而最新的研究顯示CD4+T細胞尤其是Thl/Th17的激活是清除金葡菌的關鍵點,提示有效激活T淋巴細胞可作為金葡菌疫苗研發(fā)的新思路之一。肽聚糖(Peptidoglvcan,PGN)是金葡菌細胞壁重要的保守成分,不僅能夠維持細菌的基本結構和形狀,還能保持胞內穩(wěn)定的滲透壓,被喻為細菌的“阿喀琉斯之踵”,意為強者的致命弱點,而另一保守結構LTA,在細菌自身細胞的分裂、維持細胞膜的完整性中發(fā)揮重要作用。二者均是G+菌包括金葡菌在內的保守性成分。但PGN和LTA均屬于TI抗原(胸腺非依賴抗原),免疫原性弱,不能引起有效再次免疫應答,因此限制其成為疫苗候選。近二十年來,人們關注到感染因子及腫瘤細胞表面多糖和病原體莢膜多糖等TI抗原在其致病中作用,合成肽可以模擬糖類和脂類表位。模擬肽作為糖類或脂類替代物免疫動物后可誘導針對這些TI抗原免疫應答和免疫記憶。然而線性肽分子量小,免疫原性弱,需要選擇合適載體交聯(lián)以有效暴露短肽。多價抗原肽(multiple antigenic peptide,MAP)與線性肽相比優(yōu)勢在于：分子量大、不需交聯(lián)載體,可抵抗酶降解,在設計中可選擇性加入T表位或B表位以有效誘導不同類型的免疫應答。本課題組在前期工作中利用噬菌體展示肽庫技術,篩選出能模擬PGN表位序列的陽性序列,根據其中一條序列(ATWxHxLxSAGL)合成四分枝多價抗原肽MAP-P31,以此MAP作為免疫原誘導小鼠產生針對S.aureus抗體,并對S.aureus致死性攻擊具有保護性作用,這提示PGN模擬肽可將其TI(胸腺非依賴性抗原)抗原性質轉變?yōu)門D(胸腺依賴抗原)抗原性質,并有效誘導有再次抗體應答。然而MAP-P31并不能激活T細胞增殖。在此基礎上本研究選擇另一條包含保守序列、抗原指數高于MAP-P31的序列SPHxHSRLRSES,合成線性肽SP27 (Biotin-SASPHxHSRLRSESGG)及四分枝多價抗原肽(命名為MAP27),在鑒定線性肽SP27和MAP27抗原性基礎上；探討以MAP27作為免疫原誘導保護性作用及其機制。此外,我們還進行LTA模擬肽初步篩選,獲得兩條模擬LTA的保守序列VxxDFRQxxQPS和GxxDFRQxxQPS,為后續(xù)研究奠定了基礎。本項工作包括以下兩個部分：第一部分金黃色葡萄球菌非蛋白成分PGN模擬肽保護性作用機制研究一、PGN模擬肽合成與體外鑒定1.線性肽SP27特異性結合抗PGN單抗根據前期工作,選擇含保守序列“xH”的No.27號陽性噬菌體克隆(SPHxHSRLRSES)合成線性肽SP27(Biotin-SASPHxHSRLRSESGG)和SP27b(Biotin-SPHxHSRLRSESSAGG),SA、 GG.SAGG為兩側發(fā)揮支架作用的氨基酸殘基,ELISA結果顯示：SP27和SP27b均呈劑量依賴性特異性結合抗PGN單抗,且不與抗LTA單抗反應,提示核心序列SPHxHSRLRSES模擬PGN表位。2.四分枝多價抗原肽MAP27特異結合抗PGN單抗及抗S.aure us多抗基于SP27序列,以多聚賴氨酸為支架合成四分枝多價抗原肽MAP27,ELISA結果顯示：MAP27不僅能夠特異性結合抗PGN單抗(MAP27 vs MAP(ctrl), P=0.02;MAP27 vs PBS,P=0.021)也能特異性結合抗金葡菌多克隆抗體(MAP27vs MAP(ctrl),P=0.002；MAP27 vs PBS,P=0.002), 提示MAP27維持原始線性肽SP27抗原性,模擬PGN抗原表位。3.MAP27模擬PGN表位刺激小鼠腹腔巨噬細胞分泌促炎性細胞因子100μg/ml MAP27體外刺激小鼠腹腔巨噬細胞6h,收取上清,ELISA結果顯示MAP27可刺激腹腔巨噬細胞分泌IL-6(MAP27 vs MAP(ctr1),P=0.045；MAP27 vs blank,P=0.018).IL-1β(MAP27 vs MAP(ctrl),P=0.002;MAP27 vs blank,P=0.000),提示該合成肽在一定程度上模擬了PGN的生物學活性。二、PGN模擬肽MAP27主動免疫保護作用1.免疫方法4-6周,雌性BALB/c小鼠隨機分為三組,分別以MAP27和MAP(ctrl)加弗氏佐劑進行免疫,兩次免疫間隔2周,共進行5次,第三組小鼠同期飼養(yǎng)但未進行合成肽免疫,作為空白對照。合成肽末次免疫后第七天,以2×107CFU/只滅活菌加強免疫三組小鼠(包括空白組)一次。2.MAP27免疫誘導小鼠體內產生低效價抗金葡菌抗體和抗PGN抗體每次免疫后一周檢測血清效價。結果顯示：與對照組相比,MAP27免疫組在免疫三次后即產生抗MAP27的IgG類抗體,效價達到1：104,并可維持10周。滅活金葡菌加強免疫后,MAP27免疫組小鼠產生抗金葡菌超聲裂解產物(MAP27 vsMAP(ctrl),P=0.000;MAP27 vs blank, P=0.000)及抗PGN (MAP27 vs MAP(ctrl), P=0.026;MAP27 vs blank, P=0.015)的IgG類抗體,但效價僅在1：200倍。3.在補體存在下,兔抗MAP27抗血清體外殺菌/抑菌作用 以MAP27作為免疫原免疫新西蘭兔獲得抗血清,實驗結果顯示,在補體存在下兔抗MAP27抗血清產生對甲氧西林敏感株(MSSA,ATCC25923)較強的殺菌/抑制作用(MAP27免疫血清vs正常兔血清,P=0.000)。4.MAP27免疫誘導小鼠抵御金葡菌系統(tǒng)性感染末次滅活菌加強免疫各組小鼠,5天后以致死劑量5×108CFUMSSA攻擊(iv),觀察各組死亡率。MAP27免疫組小鼠7天內生存率為50%,空白對照組和MAP(ctrl)組小鼠分別在感染后第2天和第5天全部死亡(MAP27 vs MAP(ctrl), P=0.000;MAP27 vs blank, P=0.000);尾靜脈注射亞致死劑量2×107 CFU MSSA (ATCC25923),感染3天后取各組小鼠腎臟、肺臟,研磨后檢測臟器中細菌殘存量,結果顯示MAP27免疫組小鼠腎臟、肺臟中細菌載量顯著低于對照組(MAP27 vs MAP(ctrl), Pkidney =0.029, MAP27 vs blank, Pkidney=0.029; MAP27 vs MAP(ctrl), Plung=0.016, MAP27 vs blank,Plung=0.008)。提示MAP27免疫誘導小鼠抵御金葡菌系統(tǒng)性感染。三、PGN模擬肽MAP27誘導保護性作用機制的研究1.MAP27免疫組小鼠在感染早期臟器中IFN-γ、IL-17A/F和CCL3含量顯著增高末次以滅活金葡菌加強免疫各組小鼠,尾靜脈感染3天后取各組小鼠臟器,研磨后進行細胞因子檢測,ELISA結果顯示：與MAP(ctrl)組和空白對照組相比,MAP27免疫鼠脾臟、肺臟、肝臟IFN-y (MAP27 vs MAP(ctrl), Pspleen=0.001, MAP27 vs blank, Pspleen=0.000; MAP27 vs MAP(ctrl),Plung=0.000, MAP27 vs blank, Plung=0.000; MAP27 vs MAP(ctrl), Pliver=0.000, MAP27 vs blank, Pliver=0.000)和IL-17A/F (MAP27 vs MAP(ctrl), Pspleen=0.01, MAP27 vs blank, Pspleen=0.014;MAP27 vs MAP(ctrl), Plung=0.000, MAP27 vs blank, Plung=0.000;MAP27 vs MAP(ctrl), Pliver=0.000, MAP27 vs blank, Pliver=0.000)水平明顯升高；同時可有效激活巨噬細胞及中性粒細胞的趨化因子CCL3含量也明顯增多(MAP27 vs MAP(ctrl), Pspleen=0.022, MAP27 vs blank, Pspleen=0.000; MAP27 vs MAP(ctrl),Plung=0.033; MAP27 vs blank, Plung=0.016; MAP27 vs MAP(ctrl), Pliver=0.017, MAP27 vs blank, Pliver=0.014),提示MAP27免疫可能通過激活T細胞免疫應答發(fā)揮保護作用。2.MAP27免疫組小鼠在感染早期脾臟中IFN-γ+CD3+T細胞和IL-17+CD4+T細胞比例增高金葡菌感染3天后流式檢測各免疫鼠脾臟胞內IFN-γ、IL-17A表達,結果顯示與MAP(ctrl)免疫組和空白對照組相比,MAP27免疫組IFNy+CD3+T細胞比例(MAP27 vs MAP (ctrl), P=0.021;MAP27 vs blank,P=0.03)以及 IL-17A+CD4+T細胞比例明顯升高(MAP27 vs MAP (ctrl), P=0.021;MAP27 vs blank, P=0.012),提示感染早期誘導MAP27免疫鼠體內T細胞免疫應答。3.體外實驗表明,MAP27刺激免疫鼠脾細胞分泌Thl型細胞因子末次滅活菌加強免疫一次后第5天,分別取各組小鼠脾細胞,體外培養(yǎng)中以100ng/mlMAP27刺激各免疫組小鼠脾細胞24h,ELISA檢測上清中細胞因子含量。結果表明MAP27免疫鼠脾細胞上清中IL-2、IFN-γ含量顯著高于對照肽免疫組及空白對照組小鼠(IL-2:MAP27 vs MAP (ctrl), P=0.000, MAP27 vs blank, P=0.000; IFN-y:MAP27 vs MAP (ctrl), P=0.000, MAP27 vs blank, P=0.000),而IL-4含量各組別間均無差異(P0.05)；未檢測到IL-17A/F。ELISPOT結果顯示低劑量MAP27及抗小鼠CD28抗體刺激MA27免疫鼠生成IFN-y斑點形成細胞(spot-forming cells, SFCs)顯著多于MAP(ctrl)免疫組和空白組(MAP27 vs MAP (ctrl), P=0.001;MAP27 vs blank,P=0.001),提示合成肽體外刺激可能誘導免疫鼠脾細胞產生相應的Thl型細胞免疫應答。4.體外實驗表明,滅活菌刺激MAP27免疫鼠脾細胞分泌Thl和Th17細胞因子天然抗原滅活菌體外刺激各免疫鼠脾細胞72h, ELISA結果示MAP27免疫鼠脾細胞上清中IL-2/IFN-γ和IL-17A/F含量顯著高于對照肽免疫組和空白對照組(IL-2:MAP27 vs MAP (ctrl),P=0.041, MAP27 vs blank,P=0.024;IFN-y:MAP27 vs MAP(ctrl), P=0.028, MAP27 vs blank, P=0.032; IL-17A/F: MAP27 vs MAP (ctrl), P=0.039, MAP27 vs blank, P=0.043),而IL-4含量各組別間均無差異(P0.05)。ELISPOT結果示滅活菌刺激24h IFN--γ和IL-17A/F斑點形成細胞數量顯著高于對照肽組和空白對照組(IFN-γ:MAP27 vs MAP (ctrl), P=0.0126, MAP27 vs blank, P=0.0041; IL-17A:MAP27 vs MAP (ctrl), P=0.0034, MAP27 vs blank, P=0.0039),提示MAP27免疫組小鼠脾細胞可識別天然抗原并分泌Th1/Th17型細胞因子。第二部分LTA模擬肽篩選與鑒定一、應用噬菌體展示技術篩選金葡菌LTA模擬肽克隆1.噬菌體肽庫篩選以抗LTA單抗為釣餌蛋白,分別采用固相法和液相法對噬菌體12線性肽庫進行三輪篩選。固相法篩選富集率僅44倍,而液相篩選富集率可達300倍。從固相法所得第三輪洗脫產物中隨機挑選65個噬菌體克隆,雙夾心ELISA鑒定后得到18個與抗LTA單抗結合的陽性克��；從液相法第三輪洗脫產物中隨機挑選45個噬菌體克隆,夾心ELISA鑒定后僅得到4個與抗LTA單抗特異性結合的克隆。相較于固相篩選,液相篩選所得陽性克隆無非特異吸板序列。2.陽性噬菌體測序及序列分析將固相法所得18個陽性噬菌體克隆進行測序,對氨基酸序列進行分析,共得到9個不同的序列。其中第3、5、25、41、43、56、65號克隆有共同序列：VHxDFRQxxQPS,第4、21、27、32號克隆有共同序列xHxSxIYSTMNP,并與第8、17、34、36、28號噬菌體共有保守序列Hx或xx,而29、55號噬菌體克隆與上述保守序列均不同。液相法所得的4個陽性噬菌體克隆測序后進行氨基酸序列分析,得到4個完全不同的氨基酸序列,其中2號噬菌體克隆序列為GHxDFRQxxQPS,與固相法所得3號噬菌體克隆序列僅相差一個氨基酸。二、模擬肽的合成及抗原性鑒定選擇含保守序列Hx或xx的陽性噬菌體克隆合成線性肽L3-1 (HSVHxDFR QxxQPSGGGS)和L2(HSGHxDFRQxxQPSGGGS),HS、GGGS為起支架作用氨基酸殘基,ELISA結果顯示L3-1和L2均能以濃度梯度依賴方式和抗LTA單抗結合,且L3-1反應優(yōu)于L2,故根據L3-1序列合成四分枝多價抗原肽,命名為MAP3,體外ELISA鑒定顯示MAP3與抗LTA單抗能較好地結合。上述結果提示線性肽L3-1、L2及四分枝多價抗原肽MAP3模擬LTA的抗原表位,為后續(xù)研究提供基礎。
【關鍵詞】：金黃色葡萄球菌 模擬肽 疫苗 PGN LTA Th1/Th17
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R392-33
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-19
• 前言19-22
• 第一部分 金黃色葡萄球菌非蛋白成分PGN模擬肽保護作用機制研究22-58
• 第一章 PGN模擬肽合成與體外鑒定22-31
• 1.1 材料與方法22-26
• 1.2 結果26-28
• 1.3 討論28-30
• 1.4 小結30-31
• 第二章 PGN模擬肽MAP27主動免疫的保護作用31-40
• 2.1 材料與方法31-34
• 2.2 結果34-38
• 2.3 討論38-39
• 2.4 小結39-40
• 第三章 MAP27誘導保護作用機制的研究40-58
• 3.1 材料和方法40-45
• 3.2 結果45-54
• 3.3 討論54-56
• 3.4 小結56-58
• 第二部分 LTA模擬肽的篩選與初步鑒定58-77
• 1.1 材料與方法58-68
• 1.2 結果68-74
• 1.3 討論74-75
• 1.4 小結75-77
• 全文總結77-80
• 參考文獻80-89
• 中英文縮略詞89-92
• 致謝92-93
• 在讀期間待發(fā)表的文章93-94

【共引文獻】

中國博士學位論文全文數據庫 前2條

1 張念章;弓形蟲CDPKs核酸疫苗及重組亞單位疫苗的免疫保護性研究[D];中國農業(yè)科學院;2014年

2 陳衍;社區(qū)獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌克隆ST72的毒力因子研究[D];浙江大學;2014年

中國碩士學位論文全文數據庫 前1條

1 田維鵬;弓形蟲ERP基因的遺傳變異分析及ELISA方法建立與其免疫原性分析[D];東北農業(yè)大學;2014年

  本文關鍵詞：金黃色葡萄球菌非蛋白成分PGN模擬肽保護性作用機制研究及LTA模擬肽初步篩選和鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：308343