本文關(guān)鍵詞：粉塵螨新過敏原profilin蛋白克隆表達，免疫學(xué)鑒定及過敏反應(yīng)機理的初步探究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：塵螨是一種全球性過敏性疾病中的的首要過敏原,有50%的過敏性疾病患者對塵螨表現(xiàn)出過敏反應(yīng)。塵螨種類繁多,其中屋塵螨和粉塵螨是與人類過敏反應(yīng)相關(guān)的兩種重要致敏物種。據(jù)當(dāng)前文獻報道顯示,粉塵螨中已發(fā)現(xiàn)有15種過敏原,分別為Der f1,2,3,6,7,8,10,11,14,15,16,17,18,21,24,profilin作為主要過敏原在植物花粉及食物中已被報道,但國內(nèi)外尚未有關(guān)于粉塵螨profilin作為過敏原的報道。本研究以粉塵螨profilin蛋白為研究對象,通過分子生物學(xué)技術(shù)和臨床實驗數(shù)據(jù)相結(jié)合的方法,首次證明粉塵螨profilin是粉塵螨內(nèi)一種新過敏原。目的:(1)獲得粉塵螨profilin全基因序列,構(gòu)建表達載體,誘導(dǎo)表達獲得大量重組蛋白并鑒定進行臨床皮膚測試(SPT)。(2)通過粉塵螨profilin重組蛋白建立小鼠過敏性哮喘模型,評價其免疫原性。(3)通過臨床過敏性患者血清特異性Ig E結(jié)合檢測塵螨profilin與魚尾葵花粉和芒果果實profilin的交叉反應(yīng)性。(4)通過細(xì)胞因子誘導(dǎo)小鼠骨髓內(nèi)單核細(xì)胞分化獲得DC細(xì)胞,對粉塵螨profilin的致敏機理進行初步探索。方法:(1)根據(jù)合作單位香港中文大學(xué)提供的粉塵螨profilin全基因序列設(shè)計引物,提取粉塵螨總RNA,克隆得到粉塵螨profilin蛋白基因并連接至表達載體,IPTG誘導(dǎo)表達菌后,獲得菌體產(chǎn)物進行Ni-NTA親和層析純化并獲得的高純度蛋白。通過Ig E-Western blotting(Ig E-WB)實驗、Ig E-ELISA實驗和人體皮膚點刺實驗(SPTs)等試驗對重組蛋白進行過敏原性鑒定;(2)18只BALB/c小鼠隨機分成3組,A組為粉塵螨粗提液組(DME組),B組為粉塵螨profilin重組蛋白組(profilin組),C組PBS正常對照組(control組);A組用100μg塵螨粗浸液加4mg氫氧化鋁致敏,B組注射100μg塵螨重組profilin加4mg氫氧化鋁致敏,C組小鼠用磷酸鹽緩沖液(PBS)取代過敏原進行皮下注射。第3、7天加強致敏,在第14天將所有小鼠麻醉后,A組和B組分別用50μg塵螨粗浸液和重組profilin滴鼻激發(fā),C組用等量的PBS代替變應(yīng)原,進行滴鼻激發(fā),每天1次,連續(xù)7天。最后一次激發(fā)24h后,所有小鼠通過全體積掃描儀進行氣道高反應(yīng)性檢測;取血,分離脾臟,進行支氣管肺泡灌洗(BALF)并對總細(xì)胞數(shù)及炎性細(xì)胞數(shù)進行統(tǒng)計;通過HE染色病理切片觀察肺部的炎癥反應(yīng);MTS試劑盒檢測脾細(xì)胞增殖水平;用ELISA法檢測血清中抗原特異性抗體Ig E和Ig G1,及脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中INF-γ和IL-4的分泌水平。(3)與粉塵螨profilin方法類似,克隆表達獲得魚尾葵花粉和芒果profilin重組蛋白。同時分別收集20份臨床粉塵螨、15份魚尾葵花粉及15份芒果過敏性患者血清作為一抗,通過ELISA實驗判斷塵螨profilin與魚尾葵花粉及芒果過敏原profilin之間的交叉反應(yīng)性。將誘導(dǎo)獲得的小鼠原代樹突狀細(xì)胞(DCs)分為4組,即profilin刺激組、profilin+TLR4阻斷抗體組和空白對照組。通過q-PCR及Western方法檢測TIM4的表達量。結(jié)果:①克隆profilin樣蛋白基因序列,成功構(gòu)建p ET28a-profilin表達載體,在大腸桿菌宿主菌內(nèi)高效表達,經(jīng)純化獲得大量可溶性重組蛋白。臨床皮試點刺實驗結(jié)果顯示,在14例粉塵螨過敏性患者中有3例呈現(xiàn)出對profilin的陽性反應(yīng)。Western Blot和ELISA實驗也表明粉塵螨profilin與3例陽性患者的血清內(nèi)Ig E有較強的結(jié)合能力,而健康對照組血清均為陰性。②由粉塵螨profilin重組蛋白建立的小鼠過敏性哮喘模型檢測結(jié)果如下:A組和B組小鼠較C組肺部發(fā)生明顯的炎癥反應(yīng);肺泡灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)顯著高于C組(P㩳0.01);A組和B組血清中抗原特異性Ig E、Ig G1的分泌水平均明顯高于C組,但兩組之間無明顯差異;脾細(xì)胞的增殖與細(xì)胞因子分泌水平變化:小鼠在受到粉塵螨粗提液及粉塵螨profilin重組蛋白刺激后增殖明顯;B組小鼠脾細(xì)胞IL-4的分泌水平高于C組,而INF-γ的分泌水平低于C組。但二者與A組相比,均無顯著性差異。③當(dāng)粉塵螨過敏性患者血清作為一抗進行ELISA檢測,魚尾葵花粉profilin表現(xiàn)出60%的Ig E反應(yīng)性,芒果profilin有45%的Ig E反應(yīng)性。反之,以魚尾葵花粉和芒果過敏性患者血清作為一抗時,塵螨profilin分別表現(xiàn)出20%和26.7%陽性反應(yīng)。粉塵螨profilin在樹突狀細(xì)胞(DCs)表面受體TLR4介導(dǎo)下引起表面分子TIM4表達上調(diào),進而引發(fā)機體Th2型過敏反應(yīng)。結(jié)論:本研究通過基因工程技術(shù)克隆表達了粉塵螨過敏原profilin,經(jīng)一系列鑒定表明它是粉塵螨過敏原組分中又一新發(fā)現(xiàn)過敏原。這為其他過敏原的發(fā)現(xiàn)和鑒定提供思路,同時奠定了過敏性疾病的機制研究、診斷和治療的基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：粉塵螨profilin 過敏原性 動物模型 TIM4 交叉反應(yīng)性
【學(xué)位授予單位】：深圳大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-14
• 緒論14-21
• 1. 塵螨對過敏性哮喘的影響14-15
• 2. 重組過敏原的優(yōu)勢及研究現(xiàn)狀15-17
• 3. 過敏性哮喘動物模型17-18
• 4. 過敏反應(yīng)機理研究18-19
• 5. 本課題的研究意義19-21
• 第1章 粉塵螨profilin重組蛋白克隆表達純化21-36
• 1.1 實驗材料和方法21-30
• 1.1.1 粉塵螨、過敏性患者血清、菌種及質(zhì)粒21
• 1.1.2 主要實驗儀器21-22
• 1.1.3 主要實驗試劑及耗材22
• 1.1.4 主要溶液配制22-25
• 1.1.5 粉塵螨profilin基因克隆及蛋白表達純化25-29
• 1.1.6 免疫學(xué)鑒定29-30
• 1.2 結(jié)果30-35
• 1.2.1 RT-PCR擴增粉塵螨profilin片段30-31
• 1.2.2 粉塵螨profilin基因序列比對31-32
• 1.2.3 克隆表達載體構(gòu)建及鑒定32-33
• 1.2.4 重組蛋白表達及純化33
• 1.2.5 皮膚點刺33-34
• 1.2.6 Western Blot和Elisa檢測臨床患者血清IgE反應(yīng)性34-35
• 1.3 討論35-36
• 第2章 粉塵螨profilin過敏性哮喘小鼠模型建立36-45
• 2.1 實驗材料及方法36-39
• 2.1.1 動物及致敏原蛋白36
• 2.1.2 主要實驗儀器36
• 2.1.3 主要實驗試劑36
• 2.1.4 主要試劑配制36
• 2.1.5 動物分組及塵螨粗浸液制備36-37
• 2.1.6 氣道高反應(yīng)性檢測37
• 2.1.7 血清中特異性IgE和IgG1 檢測37
• 2.1.8 肺泡灌洗液（BALF）中炎癥細(xì)胞計數(shù)及細(xì)胞因子檢測37-38
• 2.1.9 脾細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子檢測38
• 2.1.10 肺組織病理學(xué)切片38-39
• 2.1.11 統(tǒng)計學(xué)處理39
• 2.2 結(jié)果39-43
• 2.2.1 氣道高反應(yīng)性檢測39-40
• 2.2.2 血清中特異性抗體IgE、IgG1 檢測40
• 2.2.3 肺泡灌洗液（BALF）中炎癥細(xì)胞計數(shù)及細(xì)胞因子檢測40-42
• 2.2.4 淋巴細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子檢測42-43
• 2.2.5 肺組織病理學(xué)切片43
• 2.3 討論43-45
• 第3章 粉塵螨profilin與其他物種profilin交叉反應(yīng)性和致敏機理初步探究45-53
• 3.1 實驗材料及方法45-47
• 3.1.1 實驗動物及主要試劑45
• 3.1.2 主要實驗儀器45
• 3.1.3 表達純化重組蛋白45
• 3.1.4 粉塵螨與魚尾葵花粉profilin交叉反應(yīng)性45-46
• 3.1.5 粉塵螨與芒果profilin交叉反應(yīng)性46
• 3.1.6 誘導(dǎo)分化獲得小鼠原代樹突狀細(xì)胞（BMDCs）46
• 3.1.7 過敏原刺激原代樹突狀細(xì)胞（DCs）46
• 3.1.8 Western Blot檢測TIM4 蛋白表達46-47
• 3.1.9 實時熒光定量PCR檢測DC細(xì)胞表面分子TIM4 蛋白表達47
• 3.2 結(jié)果47-51
• 3.2.1 表達純化獲得三種profilin蛋白47
• 3.2.2 粉塵螨profilin與魚尾葵花粉profilin交叉反應(yīng)性47-48
• 3.2.3 粉塵螨profilin與芒果profilin蛋白之間的交叉反應(yīng)性48-49
• 3.2.4 DCs在粉塵螨profilin刺激下表面分子TIM4 上調(diào) .. 3649-51
• 3.3 討論51-53
• 結(jié)論53-54
• 參考文獻54-60
• 附錄60-63
• 致謝63-64
• 攻讀碩士學(xué)位期間的研究成果64-65

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 馬萍;邢杰;閆玉文;;過敏性支氣管哮喘動物模型研究現(xiàn)狀[J];武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2010年08期

2 郝敏麒,徐軍,鐘南山;塵螨致敏小鼠肺部變應(yīng)性炎癥模型的建立[J];中國病理生理雜志;2003年01期

3 李國平 ,劉志剛 ,鐘南山;重組Derp2變應(yīng)原誘導(dǎo)小鼠變態(tài)反應(yīng)氣道炎癥動物模型的建立[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2005年07期

  本文關(guān)鍵詞：粉塵螨新過敏原profilin蛋白克隆表達，免疫學(xué)鑒定及過敏反應(yīng)機理的初步探究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：306795