目的構(gòu)建人源性禽流感病毒H7N9單鏈抗體文庫（scFv）,并對(duì)文庫質(zhì)量進(jìn)行鑒定。方法分離11例H7N9恢復(fù)期患者外周血中的單個(gè)核淋巴細(xì)胞（PBMC）,提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA;并以此為模板PCR擴(kuò)增人源性抗體重鏈可變區(qū)（VH）及輕鏈可變區(qū)（Vκ）,再通過重疊PCR法將VH和Vκ基因隨機(jī)拼接成scFv文庫;將構(gòu)建的scFv文庫克隆入噬菌體載體pComb3XSS中,電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞XL1-Blue,制備成完整的人源性禽流感病毒H7N9單鏈抗體文庫;通過計(jì)算菌落數(shù)量及基因測(cè)序檢測(cè)分析scFv文庫的庫容量及多樣性。結(jié)果構(gòu)建的人源性禽流感病毒H7N9單鏈抗體文庫的庫容為1.67×107,測(cè)序結(jié)果顯示scFv文庫多樣性好,scFv基因陽性率為94.0%,準(zhǔn)確率為95.7%。結(jié)論成功構(gòu)建人源性禽流感病毒H7N9單鏈抗體文庫,為后續(xù)篩選特異性中和抗體提供了基礎(chǔ)。 

【文章來源】：江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué). 2019,30(06)

【文章頁數(shù)】：3 頁

【部分圖文】：

Vκ基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

以VH及Vκ基因?yàn)槟０�，利�?對(duì)重疊PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增拼接，獲得分子量約為750bp的目的條帶，拼接產(chǎn)物分子量大小與理論值相符，見圖3。2.3 H7N9人源性scFv文庫的構(gòu)建及鑒定

根據(jù)平板A上的菌落數(shù)計(jì)算所構(gòu)建文庫庫容為1.67×107，即經(jīng)1次電轉(zhuǎn)化獲得一個(gè)庫容量為1.67×107的H7N9人源性scFv文庫；從其中挑選50個(gè)單克隆用overlap-PCR引物進(jìn)行鑒定，顯示47個(gè)克隆為PCR陽性，見圖4，文庫scFv基因陽性率為94.0%；序列測(cè)定分析47個(gè)鑒定陽性的單克隆，發(fā)現(xiàn)47個(gè)克隆中45個(gè)為正確的序列插入且堿基序列不重復(fù)，準(zhǔn)確率為95.7%，見圖5。圖5 45個(gè)陽性克隆scFv基因序列的進(jìn)化樹分析

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]天然人源性單鏈抗體文庫的構(gòu)建及鑒定[J]. 張文帥,遲瑩,焦永軍.  江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué). 2017(03)
[2]抗體組庫技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 張黎,史智揚(yáng).  江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué). 2014(04)



本文編號(hào)：3032884