本文關(guān)鍵詞：細(xì)粒棘球絳蟲不同發(fā)育階段表達(dá)譜的差異分析及特異性診斷抗原篩選的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:利用生物信息學(xué)的方法和技術(shù)原理,對細(xì)粒棘球絳蟲不同發(fā)育階段基因的表達(dá)譜進(jìn)行差異比較和生物學(xué)功能分析,找出細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴階段特有的抗原分子,為篩選包蟲病特異性診斷抗原奠定基礎(chǔ)。方法:1.細(xì)粒棘球絳蟲不同發(fā)育階段表達(dá)譜的差異分析:對國家人類基因組研究中心(CHGCS)公開發(fā)表在http://chgc.sh.cn/Eg的細(xì)粒棘球絳蟲m RNA測序數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析,根據(jù)數(shù)據(jù)庫中測得的細(xì)粒棘球絳蟲不同發(fā)育階段的reads飽和度和RPKM表達(dá)豐度,篩選出在六鉤蚴階段不表達(dá)而在原頭蚴階段高表達(dá)的基因。2.使用uniprot和Softberry Prediction軟件對這些基因進(jìn)行亞細(xì)胞學(xué)定位,篩選出表達(dá)膜蛋白或者胞外分泌蛋白的基因。應(yīng)用DNA Star、NCBI/BLAST公共數(shù)據(jù)庫和www.Predictprotein.org在線數(shù)據(jù)庫對這些編碼膜蛋白或胞外分泌蛋白的基因進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析、抗原表位預(yù)測和同源性比較分析,進(jìn)一步縮小范圍,找出適合做診斷抗原的分子。3.選擇其中的一個分子進(jìn)行重組表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)(1)根據(jù)所獲取的目的片段的序列設(shè)計(jì)引物,TRIZOL法提取人源細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴的總RNA,采用RT-PCR擴(kuò)增目的基因;(2)將目基因克隆到p GEM-T載體,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109中;(3)將目的基因克隆到p ET-28a表達(dá)載體中并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白,經(jīng)含Ni2+的His-bind樹脂柱純化,獲得純化的重組蛋白。4.重組蛋白的免疫學(xué)特性分析(1)利用重組蛋白免疫動物,獲得抗血清;(2)用r EG-01883免疫小鼠得到抗血清,通過ELISA和Western-blot的方法,對該重組蛋白的免疫學(xué)特性進(jìn)行分析與鑒定。5.初步評估該分子對的潛在診斷價值:使用該重組蛋白包被ELISA板,分別使用包蟲病人和正常人的血清予以識別,對該重組蛋白的潛在診斷價值進(jìn)行判斷與評估。結(jié)果:1.通過差異篩選,從7218個六鉤蚴中不表達(dá)而原頭蚴表達(dá)的分子中獲得319個原頭蚴階段特異性高表達(dá)基因。2.生物信息學(xué)方法最終確定了26個編碼膜蛋白或胞外分泌蛋白的基因。3.選擇其中的一個分子EG-01883成功構(gòu)建基因工程菌株EG-01883/p ET-28a/BL21(DE3),表達(dá)并純化出分子量約36k D的蛋白。4.ELISA結(jié)果顯示顯示:?用純化的重組蛋白r EG-01883免疫小鼠,可以誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性Ig G抗體;?免疫后血清細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4的變化水平均較佐劑組與對照組顯著升高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),表明該蛋白可刺激小鼠產(chǎn)生強(qiáng)烈免疫應(yīng)答;?Western blot結(jié)果顯示,該重組抗原可被His-Tag標(biāo)簽抗體、重組蛋白免疫小鼠血清以及本室保存繼發(fā)感染血清識別,而不被空白組小鼠血清識別。5.重組蛋白r EG-01883能被包蟲病人血清特異性識別,且與正常人血清相比具有顯著性差異,(p0.05)。結(jié)論:重組蛋白EG-01883具有較好的免疫原性和抗原性,能識別包蟲病人血清,有成為臨床診斷抗原的潛在價值。
【關(guān)鍵詞】：細(xì)粒棘球絳蟲 生物信息學(xué) 診斷抗原 免疫學(xué)特性
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.734;R383.33
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• 前言12-15
• 第一部分 細(xì)粒棘球絳蟲表達(dá)譜的差異分析15-24
• 1 材料15
• 2 方法15-17
• 結(jié)果17-22
• 討論22-24
• 第二部分 重組表達(dá)載體的構(gòu)建24-41
• 1 實(shí)驗(yàn)材料24-26
• 2 方法26-35
• 結(jié)果35-41
• 第三部分 重組蛋白rEG-01883免疫學(xué)特性分析41-51
• 1 材料41
• 2 方法41-45
• 結(jié)果45-48
• 討論48-51
• 結(jié)論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-56
• 綜述56-68
• 綜述參考文獻(xiàn)62-68
• 致謝68-69
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文69-70
• 個人簡歷70

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4 高s，

本文編號：302288