結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）是導(dǎo)致人類結(jié)核病（tuberculosis,TB）的病原菌,全世界大約有三分之一的人口潛伏感染結(jié)核分枝桿菌。有研究表明,雙組分調(diào)控系統(tǒng)KdpD/E在結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞的過程中發(fā)揮重要作用,并參與細(xì)菌毒力的調(diào)節(jié),但具體的作用機(jī)制目前尚不清楚。本研究在結(jié)核分枝桿菌中缺失了雙組分調(diào)控系統(tǒng)KdpD/E,并對(duì)該系統(tǒng)在入侵巨噬細(xì)胞、胞內(nèi)存活以及毒力調(diào)節(jié)過程中的作用進(jìn)行了研究。1.雙組分調(diào)控系統(tǒng)KdpD/E基因缺失株的構(gòu)建與鑒定構(gòu)建目的基因等位交換底物并克隆到含有溫敏型分枝桿菌噬菌體元件的穿梭載體phAE159上,等位交換底物經(jīng)噬菌體高效傳遞到待敲除菌株中。利用潮霉素抗性篩選陽(yáng)性克隆子并通過PCR進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明結(jié)核分枝桿菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)KdpD/E基因缺失株ΔkdpD、ΔkdpE、ΔkdpDE構(gòu)建成功。2.基因缺失株與野生株生物學(xué)特性的比較本研究通過測(cè)定缺失株與野生株OD600以及CFU與時(shí)間的對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線,發(fā)現(xiàn)雙組分調(diào)控系統(tǒng)KdpD/E的缺失對(duì)菌株的生長(zhǎng)未造成明顯的影響。實(shí)驗(yàn)還比較了基因缺失株和野生株在固體培養(yǎng)基上的菌落... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：65 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語(yǔ)表（Abbreviation）
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 結(jié)核分枝桿菌概述
        1.1.1 結(jié)核分枝桿菌病原學(xué)
        1.1.2 結(jié)核分枝桿菌流行病學(xué)
    1.2 結(jié)核分枝桿菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)
        1.2.1 結(jié)核分枝桿菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)概述
        1.2.2 結(jié)核分枝桿菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)KdpD/E研究進(jìn)展
2 研究目的與意義
3 材料與方法
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 菌株、質(zhì)粒載體和細(xì)胞
        3.1.2 主要試劑及試劑盒
        3.1.3 培養(yǎng)基及抗生素的配制
        3.1.4 主要溶液的配制
        3.1.5 引物
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 結(jié)核分枝桿菌基因組DNA的提取
        3.2.2 同源重組載體的構(gòu)建
        3.2.3 高滴度噬菌體裂解液的制備
        3.2.4 噬菌體感染待敲除菌株以及基因缺失株的鑒定
        3.2.5 基因缺失株生長(zhǎng)特性的研究
        3.2.6 THP-1 細(xì)胞入侵實(shí)驗(yàn)和胞內(nèi)存活實(shí)驗(yàn)
        3.2.7 KdpE蛋白的原核表達(dá)及純化
        3.2.8 兔抗KdpE蛋白多克隆抗體的制備
        3.2.9 結(jié)核分枝桿菌總RNA的提取
        3.2.10 熒光定量PCR
4 結(jié)果與分析
    4.1 同源重組載體的構(gòu)建
        4.1.1 pYUB1471重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.1.2 phAE159重組質(zhì)粒的構(gòu)建
    4.2 基因缺失株的鑒定
    4.3 基因缺失株生長(zhǎng)特性的研究
        4.3.1 生長(zhǎng)曲線的繪制
        4.3.2 菌落形態(tài)的比較
    4.4 THP-1 細(xì)胞入侵實(shí)驗(yàn)和胞內(nèi)存活實(shí)驗(yàn)
    4.5 KdpE蛋白的原核表達(dá)及純化
        4.5.1 pET-28a-kdp E重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.5.2 KdpE蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化
    4.6 兔抗KdpE蛋白多克隆抗體的制備
    4.7 結(jié)核分枝桿菌總RNA的提取
    4.8 熒光定量PCR檢測(cè)差異表達(dá)基因
5 討論
    5.1 結(jié)核分枝桿菌基因缺失方法的探討
    5.2 KdpD/E的缺失對(duì)結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)特性的影響
    5.3 KdpD/E的缺失對(duì)結(jié)核分枝桿菌在感染巨噬細(xì)胞過程中的影響
    5.4 反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白KdpE的表達(dá)和多克隆抗體的制備
    5.5 KdpD/E的缺失對(duì)結(jié)核分枝桿菌重要功能基因的影響
6 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]不同破壁方法提取結(jié)核分枝桿菌總RNA的比較[J]. 羅影殊,黃偌穎,劉衡川,高文鳳.  中國(guó)防癆雜志. 2013(03)
[2]結(jié)核分枝桿菌總RNA提取方法的比較研究[J]. 賈紅彥,李自慧,杜博平,邢愛英,孫琦,張宗德.  臨床肺科雜志. 2012(07)
[3]糞腸球菌總RNA提取方法的比較研究[J]. 鄒彬彬,漆涌,伍勇.  湖南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版). 2009(02)



本文編號(hào)：3006692