本文關(guān)鍵詞：B型流感病毒感染性克隆的構(gòu)建及其免疫原性研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：B型流感病毒(Influenza B virus)是正黏病毒科流感病毒屬的成員,是單股、負鏈、分節(jié)段的RNA病毒,以B/Yamagata/16/88和B/Victoria/2/87為代表株分為兩個譜系。B型流感病毒的形態(tài)與A型流感病毒相似,但只感染人類。作為季節(jié)性流感的一種,B型流感病毒常在流感季節(jié)里引起局部的暴發(fā)和流行。流行病學監(jiān)測結(jié)果表明,每年流行的B型流感病毒譜系并不相同。這對其免疫預防提出了挑戰(zhàn)�；诜聪蜻z傳學技術(shù),對流感病毒基因片段進行基因重配和基因重組,進而快速生產(chǎn)流感疫苗,是流感疫苗研究的一個新的重要方向。實驗?zāi)康?本研究擬構(gòu)建B型流感病毒B/Yamagata/16/88株的感染性克隆即反向遺傳操作平臺,并對拯救病毒株的致病性、免疫原性和免疫保護效力進行初步評價,為下一步以該平臺為基礎(chǔ)篩選B型流感病毒減毒疫苗株打下基礎(chǔ)。實驗內(nèi)容及方法:1.B型流感病毒B/Yamagata/16/88株的反向遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建和鑒定。(1)根據(jù)Genbank上公布的B/Yamagata/16/88株的基因序列,對其內(nèi)部8個基因片段進行全基因合成,并設(shè)計其反向引物。(2)將8個基因片段分別與PBD載體進行連接,通過分子克隆等方法構(gòu)建8個轉(zhuǎn)染質(zhì)粒,進行PCR鑒定和測序鑒定。(3)將鑒定正確的8個轉(zhuǎn)染質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞和SPF級雞胚,進行病毒的拯救,拯救的B型流感病毒即親本株,命名為B-S9。(4)對拯救的病毒進行形態(tài)學、分子生物學鑒定,并檢測其毒力及其在MDCK細胞的復制情況。2.拯救病毒株B-S9的致病性實驗。(1)測定拯救病毒株B-S9的EID50結(jié)果,將BS9分別稀釋成106 EID50/50μl、105EID50/50μl等不同劑量,鼻腔接種麻醉后的BALB/c小鼠。(2)106 EID50攻毒劑量組,在攻毒后第3天取小鼠肺臟、鼻甲骨、腦、肝、脾、腎及腸等組織,第6天取小鼠的肺臟;105EID50攻毒劑量組小鼠,在攻毒后第3天和第6天分別取肺臟,用SPF雞胚滴定各組織的病毒滴度。(3)攻毒后14d內(nèi)稱量各組小鼠體重,并觀察死亡情況。3.拯救病毒株B-S9的免疫原性實驗。(1)將BALB/c小鼠分為滴鼻組和肌注組,滴鼻組小鼠鼻腔接種105 EID50/50μl的病毒液,肌注組注射256倍血凝效價單位的滅活的B-S9病毒。(2)兩組小鼠免疫三周后,采集小鼠血清,以拯救病毒株B-S9為抗原,分別檢測兩組小鼠血清的中和抗體效價和血凝抑制抗體效價。(3)以2013-2014候選疫苗株NYMC BX-51B為抗原,分別檢測兩組小鼠血清中的血凝抑制抗體效價。4.拯救病毒株B-S9的免疫保護實驗。(1)將病毒株B-S9分別以鼻腔接種和肌肉注射兩種方式對BALB/c小鼠進行免疫,3周后攻毒。(2)用106 EID50/50μl劑量的親本株B-S9和106 EID50/50μl劑量的2013-2014候選疫苗株NYMC BX-51B對免疫小鼠進行攻毒,觀察14d內(nèi)小鼠死亡情況,并稱量小鼠體重。(3)攻毒第3天和第6天分別取各組小鼠的肺臟組織,進行臟器滴定。實驗結(jié)果:1.拯救了一株B型流感病毒B/Yamagata/16/88株,拯救的病毒株命名為B-S9。PCR鑒定顯示和B型流感病毒各基因片段大小一致;B-S9進行RT-PCR測序后,經(jīng)過比對,其序列和Genbank上公布的一致;電鏡下觀察到流感病毒粒子。B-S9在SPF級雞胚和MDCK細胞上病毒的毒力分別為108.75 EID50/ml和107.5 TCID50/ml,并測定其在MDCK細胞的生長曲線。2.攻毒劑量105EID50組和106EID50組小鼠體重明顯下降,對照組小鼠體重緩慢上升,不同攻擊劑量組的小鼠生存率均為100%。在14d觀察期內(nèi),小鼠未出現(xiàn)死亡情況,所以其MLD50106.5 EID50。B-S9僅在肺臟和鼻甲骨中復制,其他組織未檢測到病毒。感染小鼠的肺臟病毒滴定結(jié)果表明病毒株B-S9的復制高峰在第3天,第6天時病毒的滴度下降。3.小鼠免疫實驗中,以拯救病毒株B-S9為抗原,中和抗體檢測結(jié)果表明滴鼻免疫比肌注免疫的中和抗體效價高,小鼠血清中的血凝抑制抗體檢測結(jié)果是滴鼻組高于肌注組。用2013-2014候選疫苗株NYMC BX-51B進行HI檢測,顯示兩組小鼠血清中也有該病毒的HI抗體,但是效價較低。4.免疫小鼠經(jīng)親本株B-S9攻毒后,對照組體重下降明顯,滴鼻組未有明顯下降,肌注組有小幅下降。滴鼻組小鼠肺臟未有病毒復制,肌注組小鼠肺臟僅在第3天檢測到病毒復制,對照組小鼠有高水平復制。免疫小鼠經(jīng)2013-2014候選疫苗株NYMC BX-51B攻毒后,滴鼻組、肌注組小鼠體重變化不大,對照組小鼠體重小幅下降。滴鼻免疫小鼠肺臟沒有檢測到病毒的復制,肌注組小鼠肺臟病毒復制第3天要高于第6天,對照組小鼠肺臟有高水平復制。上述結(jié)果表明該毒株有可能產(chǎn)生免疫保護。實驗結(jié)論:1.構(gòu)建了B型流感病毒B/Yamagata/16/88株的8質(zhì)粒反向遺傳操作系統(tǒng),并對其進行了鑒定。2.拯救病毒株B-S9對BALB/c小鼠有致病性,建立了B型流感病毒BALB/c小鼠的感染模型。3.拯救病毒株不同免疫途徑免疫BALB/c小鼠3周后,小鼠血清中可以產(chǎn)生中和抗體和血凝抑制抗體,滴鼻免疫效果要好于肌注免疫。4.對拯救的B型流感病毒株進行免疫保護實驗,滴鼻免疫組小鼠可以產(chǎn)生更好的免疫保護效果,可以抵抗B型流感病毒親本株和2013-2014候選疫苗株NYMC BX-51B的攻擊。本研究的創(chuàng)新點:1.建立了B型流感病毒B/Yamagata/16/88株的反向遺傳操作系統(tǒng),為下一步的相關(guān)研究打下了基礎(chǔ)。2.建立了B型流感病毒B/Yamagata/16/88株的BALB/c小鼠的感染模型,并對其致病性、免疫原性和免疫保護效果進行了初步評價。
【關(guān)鍵詞】：B型流感病毒 反向遺傳學 致病性 免疫原性 免疫保護
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 縮略詞表7-9
• 中文摘要9-12
• Abstract12-15
• 前言15-16
• 第一篇 研究內(nèi)容16-46
• 第一章 B型流感病毒B/Yamagata/16/88 株反向遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建和鑒定16-25
• 1 材料17-18
• 1.1 質(zhì)粒、細胞和雞胚17
• 1.2 主要試劑17
• 1.3 主要儀器17-18
• 2 方法18-21
• 2.1 基因合成與引物設(shè)計18-19
• 2.2 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的構(gòu)建19
• 2.3 病毒的拯救19
• 2.4 拯救病毒的PCR鑒定和測序鑒定19-20
• 2.5 拯救病毒的電鏡鑒定20
• 2.6 拯救病毒的毒力檢測20-21
• 2.7 拯救病毒的體外復制動力學21
• 3 結(jié)果21-24
• 3.1 B型流感病毒合成質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果21-22
• 3.2 拯救病毒株B-S9 的PCR鑒定和測序鑒定結(jié)果22-23
• 3.3 拯救病毒的EID50測定結(jié)果23
• 3.4 拯救病毒的TCID50檢測結(jié)果23
• 3.5 電鏡觀察結(jié)果23
• 3.6 拯救病毒的一步生長曲線檢測23-24
• 4 討論24
• 5 小結(jié)24-25
• 第二章 拯救病毒的致病性評價和免疫原性評價25-35
• 1 材料25-26
• 1.1 毒株、細胞、雞胚和實驗動物25-26
• 1.2 主要材料26
• 1.3 主要儀器26
• 2 方法26-29
• 2.1 病毒的準備26
• 2.2 病毒的EID50的測定26-27
• 2.3 小鼠的攻毒實驗27
• 2.4 小鼠各臟器病毒滴定27-28
• 2.5 小鼠免疫實驗28
• 2.6 小鼠血凝抑制抗體檢測方法28-29
• 2.7 小鼠中和抗體的檢測方法29
• 3 結(jié)果29-33
• 3.1 感染小鼠的體重變化率29-30
• 3.2 感染小鼠的生存率30
• 3.3 感染小鼠半數(shù)致死量(MLD50)30-31
• 3.4 感染小鼠的組織嗜性31
• 3.5 感染小鼠肺臟的病毒滴度31-32
• 3.6 免疫小鼠的血凝抑制抗體檢測結(jié)果32-33
• 3.7 免疫小鼠的中和抗體檢測結(jié)果33
• 4 討論33-34
• 5 小結(jié)34-35
• 第三章 B型流感病毒B/Yamagata/16/88 株免疫保護效力評價35-42
• 1 材料35-36
• 1.1 毒株、雞胚和小鼠35
• 1.2 主要試劑35-36
• 1.3 主要儀器36
• 2 方法36-37
• 2.1 病毒株的準備36
• 2.2 2013-2014 候選疫苗株NYMC BX-51B的EID50的測定36
• 2.3 小鼠免疫實驗36-37
• 2.4 小鼠免疫保護實驗37
• 2.6 小鼠臟器病毒滴定實驗37
• 3 結(jié)果37-39
• 3.1 NYMC BX-51B的EID50結(jié)果37
• 3.2 B-S9 攻毒后小鼠體重變化率結(jié)果37-38
• 3.3 NYMC BX-51B攻毒后小鼠體重變化率結(jié)果38
• 3.4 B-S9 攻毒后小鼠肺臟病毒復制結(jié)果38-39
• 3.5 NYMC BX-51B攻毒后小鼠肺臟病毒復制結(jié)果39
• 4 討論39-41
• 5 小結(jié)41-42
• 結(jié)論42-43
• 參考文獻43-46
• 第二篇 文獻綜述46-64
• 參考文獻58-64
• 個人簡歷64-66
• 致謝66

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張立霞;周劍芳;舒躍龍;楊保收;何召慶;;通用型流感疫苗的研究進展[J];病毒學報;2014年01期

  本文關(guān)鍵詞：B型流感病毒感染性克隆的構(gòu)建及其免疫原性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：298746