發(fā)布時(shí)間：2021-01-15 02:31

　　為建立一種基于銅綠假單胞菌flgE基因的PCR檢測(cè)方法,本試驗(yàn)根據(jù)GenBank中已發(fā)表的銅綠假單胞菌flgE基因序列,設(shè)計(jì)合成了1對(duì)特異性引物,由銅綠假單胞菌基因組DNA中擴(kuò)增獲得了目的基因。從退火溫度、循環(huán)次數(shù)、Mg²⁺濃度、dNTPs濃度和引物濃度5個(gè)方面優(yōu)化了反應(yīng)條件,并檢測(cè)了該方法的特異性和敏感性。結(jié)果成功擴(kuò)增出了銅綠假單胞菌1 400 bp的flgE特異性基因片段,最佳退火溫度、循環(huán)次數(shù)、Mg²⁺濃度、dNTPs濃度和引物濃度分別為56℃、30個(gè)循環(huán)、1.6 mmol/L、0.2 mmol/L和0.3μmol/L。特異性試驗(yàn)表明,僅銅綠假單胞菌中可擴(kuò)增出目的片段,而多殺性巴氏桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、志賀氏菌、致病性大腸桿菌和金黃色葡萄球菌中均未擴(kuò)增出相應(yīng)片段。敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明,本方法可檢測(cè)到最低10 pg/μL的銅綠假單胞菌基因組DNA以及100 CFU/mL的病原菌。 

【文章來源】：現(xiàn)代畜牧獸醫(yī). 2020,(03)

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

PCR反應(yīng)循環(huán)次數(shù)優(yōu)化結(jié)果M：DNAMarkerDL2000；1～7：循環(huán)次數(shù)分別為

現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)2020年第3期M：DNAMarkerDL2000；1～7：Mg2+濃度分別為0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4mmol/L圖4Mg2+濃度優(yōu)化結(jié)果Fig.4OptimizationofMg2+concentrationM：DNAMarkerDL2000；1～7：Mg2+濃度分別為0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24mmol/L圖5dNTPs濃度的優(yōu)化結(jié)果Fig.5OptimizationofdNTPsconcentration22.6引物濃度優(yōu)化結(jié)果將反應(yīng)體系中的引物濃度分別設(shè)置為0～0.6μmol/L，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖6所示。當(dāng)反應(yīng)體系中不含引物時(shí)未擴(kuò)增出目的條帶，反應(yīng)體系中的引物濃度為0.2～0.6μmol/L時(shí)均有目的條帶出現(xiàn)，且隨著引物濃度的增加條帶亮度逐漸增加，但當(dāng)引物濃度增加至0.3μmol/L時(shí)條帶亮度幾乎不再變化，而當(dāng)引物濃度為0.6μmol/L時(shí)條帶亮度又有所下降，因此將flgE基因PCR擴(kuò)增時(shí)的最佳引物濃度設(shè)置為0.3μmol/L。22.7特異性試驗(yàn)結(jié)果分別以多殺性巴氏桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、志賀氏菌、致病性大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的基因組DNA為模板，以本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的銅綠假單胞菌flgE基因的PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，結(jié)果如圖7所示。僅當(dāng)以銅綠假單胞菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)了與預(yù)期大小一致的目的條帶，而當(dāng)以多殺性巴氏桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、志賀氏菌、致病性大腸桿菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板時(shí)均未擴(kuò)增到目的條帶，表明本試驗(yàn)建立的基于flgE基因的銅綠假單胞菌PCR檢測(cè)方法具有良好的特異性。M：DNAMarkerDL2000；1～6：以銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌、多殺性巴氏桿菌和致病性大腸桿菌基因組DNA為模板時(shí)的擴(kuò)增結(jié)果；7：陰性對(duì)照?qǐng)D7特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.7Resultofspecificitytest22.8敏感性試驗(yàn)結(jié)果將銅綠假單胞菌基因組DNA

現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)2020年第3期M：DNAMarkerDL2000；1～7：Mg2+濃度分別為0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4mmol/L圖4Mg2+濃度優(yōu)化結(jié)果Fig.4OptimizationofMg2+concentrationM：DNAMarkerDL2000；1～7：Mg2+濃度分別為0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24mmol/L圖5dNTPs濃度的優(yōu)化結(jié)果Fig.5OptimizationofdNTPsconcentration22.6引物濃度優(yōu)化結(jié)果將反應(yīng)體系中的引物濃度分別設(shè)置為0～0.6μmol/L，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖6所示。當(dāng)反應(yīng)體系中不含引物時(shí)未擴(kuò)增出目的條帶，反應(yīng)體系中的引物濃度為0.2～0.6μmol/L時(shí)均有目的條帶出現(xiàn)，且隨著引物濃度的增加條帶亮度逐漸增加，但當(dāng)引物濃度增加至0.3μmol/L時(shí)條帶亮度幾乎不再變化，而當(dāng)引物濃度為0.6μmol/L時(shí)條帶亮度又有所下降，因此將flgE基因PCR擴(kuò)增時(shí)的最佳引物濃度設(shè)置為0.3μmol/L。22.7特異性試驗(yàn)結(jié)果分別以多殺性巴氏桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、志賀氏菌、致病性大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的基因組DNA為模板，以本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的銅綠假單胞菌flgE基因的PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，結(jié)果如圖7所示。僅當(dāng)以銅綠假單胞菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)了與預(yù)期大小一致的目的條帶，而當(dāng)以多殺性巴氏桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、志賀氏菌、致病性大腸桿菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板時(shí)均未擴(kuò)增到目的條帶，表明本試驗(yàn)建立的基于flgE基因的銅綠假單胞菌PCR檢測(cè)方法具有良好的特異性。M：DNAMarkerDL2000；1～6：以銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌、多殺性巴氏桿菌和致病性大腸桿菌基因組DNA為模板時(shí)的擴(kuò)增結(jié)果；7：陰性對(duì)照?qǐng)D7特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.7Resultofspecificitytest22.8敏感性試驗(yàn)結(jié)果將銅綠假單胞菌基因組DNA

【參考文獻(xiàn)】：
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