本文關(guān)鍵詞：靶向NS3的抗登革病毒小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)及作用機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：登革病毒(Dengue virus,DENV)是一類在熱帶與亞熱帶地區(qū)廣泛流行的病原體,其與黃熱病毒(YFV),乙型腦炎病毒(JEV)和西尼羅河病毒(WNV)等同屬于黃病毒屬家族。登革病毒包括DENV-1,DENV-2,DENV-3,DENV-4四種血清型,其中以DENV-2最為流行。人感染其中任意一型登革病毒均會(huì)導(dǎo)致一系列嚴(yán)重的傳染疾病,如登革熱(Dengue fever,DF),登革出血熱(Dengue hemorrhagic fever,DHF)以及登革熱休克綜合征(Dengue shock syndrome,DSS)。目前,全球熱帶及亞熱帶地區(qū)每年大約有3.9億人被登革病毒感染,其中9600萬人因此患病。截止目前為止人們尚未研制出有效的抗登革病毒藥物,此外疫苗的開發(fā)也由于登革病毒本身具有的抗體依賴性感染增強(qiáng)作用(Antibody dependent enhancement,ADE)變得異常艱難。因此,尋找開發(fā)出一種新的有效抗登革病毒藥物迫在眉睫。非結(jié)構(gòu)蛋白3(Non-structural protein 3,NS3)是登革病毒所編碼的一種極為重要的蛋白,其N端是一種具有絲氨酸蛋白酶催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)的類胰蛋白酶。NS3主要參與登革病毒編碼的前體蛋白剪切,這對(duì)病毒的成熟以及復(fù)制均十分關(guān)鍵。NS3的蛋白酶活性需要在NS2B的存在時(shí)才能被激活,作為輔因子的NS2B可以將NS3的酶活力提高3300-6600倍。由于復(fù)合蛋白NS2B/NS3pro(NS2B/NS3 protease)對(duì)登革病毒成熟以及復(fù)制起著至關(guān)重要的作用,目前其已成為一個(gè)重要的抗登革病毒藥物開發(fā)靶點(diǎn)。因此,NS2B/NS3pro的抑制劑的發(fā)現(xiàn)與作用機(jī)制研究具有十分重大的意義。本課題通過將p ET15b-DENV-2-NS2B/NS3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Escherichia coli BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)NS2B/NS3pro;采用鎳柱親和層析法得到高純度的NS2B/NS3pro;利用高通量篩選平臺(tái)對(duì)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)存化合物庫進(jìn)行NS2B/NS3pro抑制劑的篩選;并用MTT比色法檢測NS2B/NS3pro候選抑制劑的細(xì)胞毒性;同時(shí)采用病毒復(fù)制子抑制實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)候選化合物對(duì)DENV-2病毒復(fù)制的抑制效果;最后綜合利用酶動(dòng)力學(xué),表面等離子共振技術(shù),差式掃描量熱法,紫外光譜法,分子模擬對(duì)接以及蛋白質(zhì)定點(diǎn)突變等技術(shù)方法原理對(duì)化合物抑制NS2B/NS3pro蛋白酶活性機(jī)制進(jìn)行研究,結(jié)果表明:NS2B/NS3pro抑制劑(化合物MT02A3101)具有極低的細(xì)胞毒性同時(shí)表現(xiàn)出良好的抑制登革病毒復(fù)制活性;MT02A3101作為一個(gè)NS2B/NS3pro的競爭性抑制劑與NS2B/NS3pro底物結(jié)合口袋存在強(qiáng)烈的結(jié)合同時(shí)使NS2B/NS3pro的熱穩(wěn)定性下降從而抑制其蛋白酶活性;此外還發(fā)現(xiàn)MT02A3101與NS2B/NS3pro的106位Gln,114位Gln,132位Thr及133位Arg生成氫鍵,同時(shí)與109位Ile,115位Ile及131位Val存在疏水作用。
【關(guān)鍵詞】：登革病毒 NS2B/NS3pro抑制劑 作用機(jī)制 結(jié)合模型
【學(xué)位授予單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R373.33
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 縮略語表8-13
• 第一章 緒論13-20
• 1.1 登革病毒概述13-14
• 1.2 登革病毒蛋白14-16
• 1.2.1 結(jié)構(gòu)蛋白14-15
• 1.2.2 非結(jié)構(gòu)蛋白15-16
• 1.3 登革病毒抑制劑16-19
• 1.3.1 病毒進(jìn)入阻斷劑16-17
• 1.3.2 宿主相關(guān)因子抑制劑17
• 1.3.3 抗病毒核苷酸17-18
• 1.3.4 多聚酶抑制劑18
• 1.3.5 蛋白酶抑制劑18-19
• 1.4 本課題研究目的和意義19-20
• 第二章 登革病毒NS2B/NS3pro的表達(dá)純化20-26
• 2.1 引言20
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器20-22
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料20
• 2.2.2 試劑20-21
• 2.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器21
• 2.2.4 相關(guān)溶液配制21-22
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法22-24
• 2.3.1 感受態(tài)制備22
• 2.3.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化22
• 3.3.3 NS2B/NS3pro表達(dá)22
• 3.3.4 鎳離子親和層析柱處理22-23
• 3.3.5 NS2B/NS3pro純化23
• 3.3.6 NS2B/NS3pro活性檢測23-24
• 2.4 結(jié)果24-25
• 2.4.1 NS2B/NS3pro表達(dá)純化結(jié)果24
• 2.4.2 NS2B/NS3pro酶活性檢測結(jié)果24-25
• 2.5 討論25-26
• 第三章 登革病毒NS2B/NS3pro抑制劑的發(fā)現(xiàn)及評(píng)價(jià)26-31
• 3.1 引言26
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器26-27
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料26
• 3.2.2 試劑26
• 3.2.3 儀器26
• 3.2.4 相關(guān)溶液配制26-27
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法27-28
• 3.3.1 NS2B/NS3pro抑制劑的篩選及IC50測定27
• 3.3.2 NS2B/NS3pro抑制劑的細(xì)胞毒性測試27
• 3.3.3 NS2B/NS3pro抑制劑的抗病毒活性測定27-28
• 3.4 結(jié)果28-29
• 3.4.1 NS2B/NS3pro抑制劑及其IC5028
• 3.4.2 NS2B/NS3pro抑制劑的細(xì)胞毒性28
• 3.4.3 NS2B/NS3pro抑制劑的抗病毒活性28-29
• 3.5 討論29-31
• 第四章 登革病毒抑制劑的作用機(jī)制研究31-43
• 4.1 引言31
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器31-32
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料31
• 4.2.2 試劑31
• 4.2.3 儀器31
• 4.2.4 相關(guān)溶液配制31-32
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法32-36
• 4.3.1 抑制劑類型測定32
• 4.3.2 紫外可見光譜實(shí)驗(yàn)32
• 4.3.3 表面等離子共振實(shí)驗(yàn)32-33
• 4.3.4 差式掃描量熱實(shí)驗(yàn)33-34
• 4.3.5 分子模擬對(duì)接分析34-35
• 4.3.6 蛋白質(zhì)定點(diǎn)突變分析35-36
• 4.4 結(jié)果36-42
• 4.4.1 MT02A3101為NS2B/NS3pro的競爭性抑制劑36
• 4.4.2 MT02A3101與NS2B/NS3pro存在直接的相互作用36-38
• 4.4.3 MT02A3101降低NS2B/NS3pro的穩(wěn)定性38
• 4.4.4 MT02A3101與NS2B/NS3pro的結(jié)合模型38-42
• 4.5 討論42-43
• 第五章 結(jié)論與展望43-44
• 5.1 結(jié)論43
• 5.2 展望43-44
• 參考文獻(xiàn)44-48
• 致謝48

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 金一;余傳信;;蛋白質(zhì)及多肽類藥物長效化研究進(jìn)展[J];中國血吸蟲病防治雜志;2012年05期

  本文關(guān)鍵詞：靶向NS3的抗登革病毒小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)及作用機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：296226