本文關(guān)鍵詞：人源化抗HER3單鏈抗體基因庫的構(gòu)建及篩選，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：HER3與HER2同屬EGFR (epidermal growth factor receptor)家族的重要成員，同為跨膜酪氨酸激酶受體(RTK)，其與多種人類癌癥的形成、進展有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)HER3蛋白與HER2蛋白的表達高度相關(guān)，HER3是輔助HER2形成異源二聚體及致癌作用的重要因子之一。在乳腺癌患者中，HER2、HER3陽性率分別達到50%、41.8%。當(dāng)乳腺癌患者HER3、HER2同為陽性時，其對HER2靶向藥物曲妥珠單抗（Herceptin）的反應(yīng)效果不佳。因而，通過抑制或阻斷體內(nèi)HER3水平，可能是治療乳腺癌等癌癥的一種重要途徑。 【目的】 本研究采用人源化抗體庫構(gòu)建及篩選新思路，即將免疫后的鼠源VH-CDR3庫(librare of CDR3of variable region of the murine heavy chain)移植到修飾后的人源scFv(single-chain antibody fragment)框架上，構(gòu)建抗HER3人源化單鏈抗體基因庫，并對該人源化抗體基因庫進行篩選，以期獲得具有潛在應(yīng)用價值的抗HER3人源化單鏈抗體。另一方面擬通過本論文的實施，建立一種新的人源化抗體篩選技術(shù)，為快速獲得人源化抗體提供一個新參考。 【方法】 1.人源化抗體基因庫構(gòu)建：采用HER3抗原免疫Balb/c小鼠，當(dāng)抗血清效價達到1：200000時，從被免疫的小鼠脾細(xì)胞中提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）獲得總cDNA。以總cDNA作為模板，采用兼并引物進行PCR擴增，從而獲得鼠抗體重鏈可變區(qū)基因庫（VH），然后再以VH為模板，擴增出鼠VH-CDR3基因庫。將鼠VH-CDR3庫通過PCR擴增技術(shù)移植到經(jīng)過修飾的人源單鏈抗體VH3-VΚ1上，，實現(xiàn)抗HER3人源化抗體基因庫的構(gòu)建。 2.核糖體展示技術(shù)富集篩選：針對HER3抗原，經(jīng)三輪兔網(wǎng)紅細(xì)胞核糖體展示富集抗HER3的單鏈抗體基因。為便于后續(xù)基因庫的高效克隆和表達，對回收的人源化抗體庫進行基因結(jié)構(gòu)單元的改進，即在基因庫的N-端添加T7啟動子、SD序列、PelB等表達原件，C-末端添加攜帶2個(His)6標(biāo)簽的序列，構(gòu)建可直接用于TA克隆和表達目標(biāo)蛋白的人源化抗HER3單鏈抗體基因庫。 3.人源化抗體篩選與鑒定：展示后回收的HER3單鏈抗體基因庫通過TA克隆，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3），用菌落PCR鑒定克隆。分別用HER3抗原和抗VH3-VΚ1兔多克隆抗體等對篩到的陽性克隆的可溶性表達產(chǎn)物進行ELISA篩選，隨之對親和力較高的菌株表達產(chǎn)物進行純化并測定其親和常數(shù)。 【結(jié)果】 本研究成功構(gòu)建了一個庫容達1012的人源化抗HER3單鏈抗體基因庫，經(jīng)過三輪核糖體展示對抗HER3抗體基因庫進行了富集，通過改良的TA克隆技術(shù)對目標(biāo)基因庫進行了克隆、表達以及產(chǎn)物鑒定。通過對親和力較高菌株的表達產(chǎn)物進行純化并測定其親和常數(shù)，成功獲得親和力達3.02110-8M的人源化抗HER3單鏈抗體。 【結(jié)論】 本研究為開發(fā)抗HER3抗體新藥研究提供了有價值的先導(dǎo)抗體分子。此外，通過本課題的執(zhí)行，建立了一種快速篩選人源化單鏈抗體的新技術(shù)途徑，從而為其它人源化抗體的篩選提供一個有價值的參考。
【關(guān)鍵詞】：HER3蛋白 人源化抗體基因庫構(gòu)建 改良TA克隆技術(shù) 抗HER3單鏈抗體
【學(xué)位授予單位】：四川抗菌素工業(yè)研究所
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要7-8
• Abstract8-10
• 1 引言10-13
• 1.1 人源化抗體10-11
• 1.1.1 人源化抗體研究背景10
• 1.1.2 人源化技術(shù)研究進展10-11
• 1.2 HER3 靶標(biāo)簡介11-12
• 1.3 單鏈抗體發(fā)展現(xiàn)況12-13
• 1.4 改良的 TA 克隆技術(shù)簡介13
• 2 抗 HER3 人源化單鏈抗體基因庫構(gòu)建13-37
• 2.1 前言13-14
• 2.2 實驗材料14-17
• 2.2.1 實驗儀器14
• 2.2.2 主要試劑14-15
• 2.2.3 引物設(shè)計及合成15-16
• 2.2.4 溶液配置16-17
• 2.3 實驗方法17-32
• 2.3.1 HER3 抗原免疫小鼠及效價檢測18-19
• 2.3.2 鼠源 cDNA 的制備19-21
• 2.3.2.1 淋巴細(xì)胞的分離19-20
• 2.3.2.2 鼠總細(xì)胞 RNA 的提取20-21
• 2.3.2.3 鼠 cDNA 的合成21
• 2.3.3 抗 HER3 人源化抗體基因庫的建立21-24
• 2.3.3.1 鼠源 VH-CDR3 基因庫制備21-22
• 2.3.3.2 人源 scFv 抗體框架區(qū)基因模板制備22-23
• 2.3.3.3 人源化抗 HER3 抗體基因庫制備23-24
• 2.3.4 核糖體展示篩選人源抗體基因庫24-27
• 2.3.5 表達型人源化單鏈抗體基因庫制備27-29
• 2.3.5.1 基因庫 N-末端表達調(diào)控序列 RTST7 domain 制備27
• 2.3.5.2 基因庫 C-末端帶 His 標(biāo)簽的 TA terminal 序列27-28
• 2.3.5.3 第三輪展示回收的 PCR 產(chǎn)物添加 TA 接頭28
• 2.3.5.4 具有表達功能的 anti-HER3 scFv 基因庫構(gòu)建28-29
• 2.3.6 人源化抗 HER3 單鏈抗體庫鑒定29-32
• 2.3.6.1 目標(biāo)基因庫測序29-31
• 2.3.6.2 酶切鑒定目的基因片段插入31
• 2.3.6.3 蛋白表達水平檢測基因庫的質(zhì)量31-32
• 2.4 實驗結(jié)果32-37
• 2.4.1 HER3 蛋白免疫小鼠效價檢測32-33
• 2.4.2 總 RNA 提取結(jié)果33
• 2.4.3 抗 HER3 人源化抗體基因庫的構(gòu)建33-34
• 2.4.4 核糖體展示富集目的基因序列34
• 2.4.5 表達型人源化單鏈抗體基因庫構(gòu)建34-35
• 2.4.6 抗 HER3 人源化單鏈抗體基因庫鑒定和初表達35-37
• 2.4.6.1 基因庫庫容估算35
• 2.4.6.2 酶切檢測35-36
• 2.4.6.3 基因庫測序檢測36
• 2.4.6.4 目標(biāo)抗體的表達鑒定36-37
• 2.5 小結(jié)37
• 3 抗 HER3 人源化 SCFV 抗體篩選及親和常數(shù)測定37-49
• 3.1 前言37-38
• 3.2 實驗材料38-41
• 3.2.1 實驗儀器38
• 3.2.2 主要試劑38
• 3.2.3 溶液配置38-41
• 3.3 實驗方法41-44
• 3.3.1 菌落 PCR 對陽性克隆進行鑒定41
• 3.3.2 陽性菌抗體可溶性表達41-42
• 3.3.3 HER3 抗原和抗 VH3-VΚ1 兔多抗篩選目標(biāo)抗體42
• 3.3.4 高活性菌株測序驗證42-43
• 3.3.5 抗 HER3 scFv 的初步純化43-44
• 3.3.6 間接 ELISA 鑒定純化樣品抗原結(jié)合活性44
• 3.3.7 篩選的高親和力抗 HER3 scFv 親和常數(shù)測定44
• 3.4 實驗結(jié)果44-48
• 3.4.1 菌落 PCR 檢測陽性克隆44-45
• 3.4.2 HER3 抗原和兔多抗篩選結(jié)果45
• 3.4.3 測序驗證45-46
• 3.4.4 樣品純化結(jié)果檢測46-47
• 3.4.5 間接 ELISA 鑒定純化樣品結(jié)合活性47-48
• 3.4.6 抗 HER3-236 scFv 抗體親和常數(shù)測定48
• 3.5 小結(jié)48-49
• 4.討論49-50
• 參考文獻50-53
• 致謝53
• 作者在讀期間科研成果簡介53-54
• 綜述：人源抗體的研究進展54-67
• 參考文獻64-67

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