目的在人食管癌ECA109細(xì)胞中表達(dá)新城疫病毒HBNU/LSRC/F3株HN基因,觀察其編碼蛋白的抗腫瘤特性。方法提取新城疫病毒總RNA,以根據(jù)HN基因開放閱讀框（登錄號(hào)為KC246549.1）和真核表達(dá)載體C-flag pcDNA3的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)的帶酶切位點(diǎn)引物通過逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）擴(kuò)增HN基因,然后連接到真核表達(dá)載體上,測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ECA109細(xì)胞,運(yùn)用免疫熒光及RT-PCR檢驗(yàn)HN基因的表達(dá),通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其表達(dá)產(chǎn)物的抗腫瘤效果。結(jié)果 HN基因正確連接到真核表達(dá)載體C-flag pcDNA3上,測(cè)序顯示HN基因序列與GenBank上已發(fā)表的HBNU/LSRC/F3株的HN序列一致。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ECA109細(xì)胞36h后,其胞質(zhì)內(nèi)可見黃綠色熒光,轉(zhuǎn)染48h后擴(kuò)增到HN基因,而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞擴(kuò)增陰性。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè),重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化腫瘤細(xì)胞凋亡率為（8.2±1.56）%,空質(zhì)粒對(duì)照組為（4.6±0.83）%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 HN基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化ECA109細(xì)胞表達(dá)HN蛋白,該蛋白具有一定的抗腫瘤活性。 

【文章來源】：中國病原生物學(xué)雜志. 2016年10期 北大核心

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

圖１ＨＮ基因的ＰＣＲ擴(kuò)增Ｍ２０００ｂｐｍａｒｋｅｒ１－３ＨＮｇｅｎｅＭ２０００ｂｐＤＮＡ標(biāo)志物１～３ＨＮＰＣＲ產(chǎn)物

鑒定，擴(kuò)增片段約為１７１６ｂｐ，與目的基因片段大小相符（圖１）。Ｍ２０００ｂｐＤＮＡ標(biāo)志物１～３ＨＮＰＣＲ產(chǎn)物圖１ＨＮ基因的ＰＣＲ擴(kuò)增Ｍ２０００ｂｐｍａｒｋｅｒ１－３ＨＮｇｅｎｅＦｉｇ．１ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＨＮｇｅｎｅ２ｃ－ＦｌａｇｐｃＤＮＡ３－ＨＮ重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Ｅ．ｃｏｌｉＴＯＰ１０感受態(tài)細(xì)胞接種于含氨芐青霉素的ＬＢ固體平板上，次日取單個(gè)陽性克隆菌落為模版進(jìn)行ＰＣＲ，擴(kuò)增片段約１７１６ｂｐ大小的片段（圖２）。陽性克隆質(zhì)粒經(jīng)ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨⅠ雙酶切，獲得１７１６ｂｐ和５．４ｋｂ左右兩條片段，與目的片段和載體片段長度大小相符（圖３）。重組質(zhì)粒測(cè)序分析顯示插入ＨＮ基因片段與ＧｅｎＢａｎｋ上報(bào)道的新城疫病毒ＨＢＮＵ／ＬＳＲＣ／Ｆ３株序列一致性為１００％。３重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的ＲＴ－ＰＣＲ驗(yàn)證測(cè)序正確的陽性重組質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染人食管癌細(xì)胞ＥＣＡ１０９細(xì)胞，３６ｈ后提取細(xì)胞總ＲＮＡ，逆轉(zhuǎn)錄為ｃＤＮＡ，采用ＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)β－ａｃｔｉｎ、ＨＮ基因，結(jié)果見圖４。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ＥＣＡ１０９細(xì)胞擴(kuò)增出６１３ｂｐ的β－ａｃｔｉｎ和約１７１６的ＨＮ基因，空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化對(duì)照僅擴(kuò)增出６１３ｂｐ的β－ａｃｔｉｎ。Ｍ４５００ｂｐＤＮＡ標(biāo)志物１、２ｃ－ＦｌａｇｐｃＤＮＡ－ＨＮ轉(zhuǎn)化菌ＰＣＲ產(chǎn)物圖２重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌菌落ＰＣＲ鑒定Ｍ４５００ｂｐｍａｒｋｅｒ１，２Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｃ－

４轉(zhuǎn)染ＥＣＡ１０９細(xì)胞ＨＮ蛋白的表達(dá)間接免疫熒光法檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的ＥＣＡ１０９細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見黃綠色熒光，而空質(zhì)粒組細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)無特異熒光（圖５）。Ａｃ－ｆｌａｇ－ｐｃＤＮＡ３－ＨＮ重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ＥＣＡ細(xì)胞Ｂｃ－ｆｌａｇ－ｐｃＤ－ＮＡ３空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)照?qǐng)D５間接免疫熒光法測(cè)ＨＮ蛋白的表達(dá)Ａｃ－ｆｌａｇ－ｐｃＤＮＡ３ｐｌａｓｍｉｄｇｒｏｕｐＢｃ－ｆｌａｇ－ｐｃＤＮＡ３－ＨＮｐｌａｓｍｉｄｇｒｏｕｐＦｉｇ．５ＡｓｓａｙｒｅｓｕｌｔｓｏｆＨＮｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＥＣＡ１０９ｃｅｌｌｓ５重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的凋亡情況流式細(xì)胞儀檢測(cè)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ＥＣＡ１０９細(xì)胞４８ｈ后的凋亡率為（８．２±１．５６）％，空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)照為（４．６±０．８３）％，空白對(duì)照為（１．０±０．３３）％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＜０．０５）（圖６）。Ａｃ－ｆｌａｇ－ｐｃＤＮＡ３－ＨＮ重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞Ｂｃ－ｆｌａｇ－ｐｃＤＮＡ３空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)照?qǐng)D６流式細(xì)胞儀檢測(cè)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ＥＣＡ１０９的凋亡率（％）Ａｃ－ｆｌａｇ－ｐｃＤＮＡ３ｐｌａｓｍｉｄｇｒｏｕｐＢｃ－ｆｌａｇ－ｐｃＤＮＡ３－ＨＮｐｌａｓ－ｍｉｄｇｒｏｕｐＦｉｇ．６ＡｐｏｐｔｏｔｉｃＥｆｆｅｃｔｏｆＥＣＡ１０９ｃｅｌｌｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｂｙｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＡｎｎｅｘｉｎＶ／ＰＩｄｏｕｂｌｅｓｔａｉｎｆｌｏｗｃｙｔｍｅｔｒｙ討論腫瘤免疫治療的目的是加強(qiáng)免疫系統(tǒng)潛在的識(shí)別和清除腫瘤細(xì)胞的能力，而這些能力通過Ｔ細(xì)胞、ＮＫ細(xì)胞、ＮＫＴ細(xì)胞、Ｂ細(xì)

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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