目的：采用成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞培養(yǎng)體系，探索結(jié)核桿菌熱休克蛋白10（Mtcpn10）是否通過參與成骨細(xì)胞增殖和破骨細(xì)胞生成，從而影響骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者局部骨代謝平衡的分子機(jī)制，為骨結(jié)核骨質(zhì)破壞基因治療尋找新的治療靶點(diǎn)。方法：1)建立體外人成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞培養(yǎng)體系：使用髂骨塊體外培養(yǎng)獲取成骨細(xì)胞，通過顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié)及堿性磷酸酶染色、堿性磷酸酶活性測定對其鑒定。破骨細(xì)胞通過外周靜脈血單個核細(xì)胞，用含RANKL和M-CSF的α-MEM培養(yǎng)液重懸后接種在含有骨膜片和蓋玻片孔板上，培養(yǎng)21d后獲得獲得破骨細(xì)胞，通過抗酒石酸酸性磷酸酶染色和瑞氏-吉姆薩染色進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)鑒定，通過甲苯胺蘭染色及電鏡觀察鑒定骨陷窩的形成；2)以10μg/mL、1μg/mL及0.1μg/mL不同濃度的r-Mtcpn10作用于上述體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞，觀察成骨細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期、堿性磷酸酶活性及鈣結(jié)節(jié)形成情況。應(yīng)用Realtime-PCR方法檢測成骨細(xì)胞OPGmRNA及RANKL mRNA，并用Western-blot免疫印跡法檢測OPG及RANKL蛋白表達(dá)情況；3)以1μg/mL、0.1μg/mL及0.01μg/... 

【文章來源】：新疆醫(yī)科大學(xué)新疆維吾爾自治區(qū)

【文章頁數(shù)】：174 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

人成骨細(xì)胞生長曲線

鈣離子濃度檢測結(jié)果表 1-2 實(shí)驗(yàn)組與對照組鈣離子濃度結(jié)果比較1-2 Comparison of the calciumion concentration between the experimental grcontrol group分組 n 鈣離子濃度（mmo（RANKL+M-CSF） 6 0.190±0.036對照組 6 0.023±0.010照組比較*P＜0.05

圖 2-1 電泳圖Figure2-1 Electrophoresis picture綜合 RNA 濃度表及電泳圖，這些 RNA 的質(zhì)量滿足熒光定量 PCR 實(shí)驗(yàn)的要反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)的引物設(shè)計(jì)：根據(jù) Genebank 設(shè)計(jì)核因子 κB 受體活配體、護(hù)骨素和內(nèi)參 3 對基因的引物、委托上海生工生物工程公司合成見表 表 2-2 引物序列Table 2-2 Primer sequencesene Length Upstream sequence Downstream sequenceNKLGPDH279bp200bp202bp5′-GGAGTTGGCCGCAGACAAGA-3′5′-CCTCTGTGAAAACAGCGTGC-3′5′-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3′5′-TAGAAGAACAGGGCGACGC5′-AGGTGTCTTGGTCGCCATTT5′-CTCCACGACGTACTCAGCG合成引物為冷凍干制品，首次使用離心后加入無菌超純水 lmL，低速震蕩

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]RANKL,a necessary chance for clinical application to osteoporosis and cancer-related bone diseases[J]. Hisataka Yasuda.  World Journal of Orthopedics. 2013(04)
[2]Historically significant events in the discovery of RANK/RANKL/OPG[J]. T John Martin.  World Journal of Orthopedics. 2013(04)
[3]成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞共培養(yǎng)及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 廖乃順,陳文列,黃云梅,陳賽楠.  中國骨傷. 2013(04)
[4]Osteoclast fusion and regulation by RANKL-dependent and independent factors[J]. Lianping Xing,Yan Xiu,Brendan F Boyce.  World Journal of Orthopedics. 2012(12)
[5]OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞相互調(diào)節(jié)中的作用[J]. 仲蕾蕾,楊冰,黃曉斌,孫元明.  中國骨質(zhì)疏松雜志. 2011(11)
[6]成骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)與鑒定[J]. 王勇平,廖燚,蔣垚.  中國組織工程研究與臨床康復(fù). 2011(33)
[7]新疆維吾爾自治區(qū)骨關(guān)節(jié)結(jié)核與肺結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、菌型分布及耐藥特點(diǎn)分析[J]. 魏繼虎,李君蓮,金格勒,綦迎成,王泉,馬瑞瑛,盛偉斌,努爾波力,陳洪濤.  中國全科醫(yī)學(xué). 2010(27)
[8]人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與成骨細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)破骨細(xì)胞方法的建立和鑒定[J]. 梅紅,李一雷,王心蕊,張麗紅,劉巍,王建民,李玉林.  吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版). 2007(05)
[9]淫羊藿苷對人成骨細(xì)胞增殖與分化的影響[J]. 殷曉雪,陳仲強(qiáng),黨耕町,馬慶軍,劉忠軍.  中國中藥雜志. 2005(04)
[10]人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞及其鑒定[J]. 殷曉雪,陳仲強(qiáng),郭昭慶,馬慶軍,黨耕町.  中國修復(fù)重建外科雜志. 2004(02)



本文編號：2925822