中華按蚊(Anopheles sinensis)是瘧疾與絲蟲病的重要媒介,在我國的分布范圍十分廣泛,是我國平原水網(wǎng)和水稻種植地區(qū)的優(yōu)勢蚊種。蚊媒控制在瘧疾防治與消除工作中具有極其重要的作用,其中以殺蟲劑室內(nèi)滯留噴灑與藥浸蚊帳為主的成蚊干預(yù)方法是目前最主要的蚊媒控制措施。溴氰菊酯殺蟲劑由于高效低毒的特點(diǎn)被長期大范圍的使用,對控制瘧疾在我國的流行起到了重要作用。近年來,全國殺蟲劑抗性監(jiān)測顯示各地的中華按蚊已經(jīng)對溴氰菊酯殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度的抗性,蚊蟲殺蟲劑抗性已經(jīng)成為當(dāng)前蚊媒控制的重要威脅。本研究通過對溴氰菊酯抗性相關(guān)細(xì)胞色素P450基因(CYP基因)在不同抗性水平的中華按蚊體內(nèi)的表達(dá)水平的比較,分析在中華按蚊溴氰菊酯抗性產(chǎn)生中發(fā)揮主要作用的CYP基因,為探索中華按蚊溴氰菊酯抗性形成的分子機(jī)制并進(jìn)一步制定相應(yīng)的抗性治理措施打下基礎(chǔ)。本研究分三個(gè)部分:一中華按蚊溴氰菊酯抗性水平檢測與分析為檢測不同地區(qū)中華按蚊對溴氰菊酯的抗性水平,本研究采用美國疾病預(yù)防控制中心(CDC)推薦的生物瓶測定法分別對實(shí)驗(yàn)室馴化和3個(gè)江蘇現(xiàn)場(常州、鹽城、泰州)采集的中華按蚊種群的溴氰菊酯抗性水平進(jìn)行檢測,并對不同地區(qū)現(xiàn)場中華按蚊樣本溴氰菊酯抗性程度進(jìn)行區(qū)分。抗性測定結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)室按蚊在接觸溴氰菊酯診斷濃度下(12.5μg/bottle)診斷時(shí)間內(nèi)(30min)死亡率為100%,證明實(shí)驗(yàn)室馴化的中華按蚊種群為溴氰菊酯敏感種群。結(jié)合不同濃度下蚊蟲死亡率并通過數(shù)據(jù)擬合得到實(shí)驗(yàn)室中華按蚊溴氰菊酯半數(shù)致死濃度(LC_(50))為3.849μg/bottle�，F(xiàn)場采集的按蚊種群中鹽城市中華按蚊樣本在125、250、375μg/bottle濃度下死亡率分別為11.11%、46.67%、100%,常州市中華按蚊樣本在375、500、625μg/bottle濃度下死亡率分別為34.48%、46.43%、100%,泰州市中華按蚊樣本在375、500、625μg/bottle濃度下死亡率分別為21.88%、40.83%、84.21%。本部分研究內(nèi)容發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室中華按蚊為溴氰菊酯敏感按蚊,而現(xiàn)場中環(huán)按蚊則均為抗性按蚊,且現(xiàn)場中華按蚊溴氰菊酯抗性水平均為高度抗性。但不同地區(qū)現(xiàn)場中華按蚊溴氰菊酯抗性水平存在明顯差異,抗性水平從高到低依次為泰州市、常州市、鹽城市。二中華按蚊溴氰菊酯抗性相關(guān)基因檢測與分析為分析中華按蚊溴氰菊酯抗性的分子機(jī)制,首先采用Allglo探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對3個(gè)現(xiàn)場中華按蚊樣本kdr基因突變情況進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示存在L1014F和L1014C兩種kdr突變類型,基因型包括TTT/TTT,TGT/TGT,TTG/TTT,TTT/TGT,無野生純合型TTG/TTG以及雜合型TTG/TGT,統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)3個(gè)現(xiàn)場中華按蚊樣本不同kdr等位基因頻率以及L1014F和L1014C兩種基因突變頻率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示3個(gè)現(xiàn)場中華按蚊樣本溴氰菊酯抗性與kdr突變有關(guān),但相互之間抗性水平的差異可能不是由kdr基因突變造成。其次,采用反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)(RT-qPCR)對3個(gè)現(xiàn)場中華按蚊樣的6個(gè)相關(guān)CYP基因(CYP6M3、CYP6Y1、CYP6P5、CYP4H14、CYP4G17、CYP12F16)表達(dá)水平進(jìn)行檢測,統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)除CYP4G17基因外其他CYP基因表達(dá)水平均是現(xiàn)場按蚊高于實(shí)驗(yàn)室按蚊,且溴氰菊酯抗性水平更高地區(qū)的中華按蚊,其體內(nèi)CYP6M3基因表達(dá)水平也越高。本部分研究內(nèi)容發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室中華按蚊kdr基因型均為野生純合型,而現(xiàn)場按蚊均為突變型,且不同地區(qū)中華按蚊kdr基因突變情況無顯著性差異,因而我們認(rèn)為中華按蚊溴氰菊酯抗性與kdr突變有關(guān),但抗性差異并非由kdr突變造成。在對抗性相關(guān)CYP基因表達(dá)檢測中發(fā)現(xiàn)CYP6M3基因表達(dá)水平與抗性水平顯著相關(guān),推測其可能是抗性主效基因。三中華按蚊溴氰菊酯抗性相關(guān)CYP基因表達(dá)特征分析為了進(jìn)一步研究溴氰菊酯抗性相關(guān)CYP基因在中華按蚊體內(nèi)的表達(dá)特征,分別對實(shí)驗(yàn)室按蚊不同發(fā)育時(shí)期:卵、幼蟲、蛹、成蚊(雌蚊、雄蚊);不同組織:唾液腺、馬氏管、中腸、卵巢以及脂肪體;不同溴氰菊酯接觸劑量:0、1.25、3.75、6.25、12.5μg/bottle;以及不同溴氰菊酯接觸時(shí)間:0、5、15、30、60分鐘這4種情況下抗性相關(guān)CYP基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測。研究發(fā)現(xiàn),CYP6M3與CYP6Y1基因在雄性成蚊體內(nèi)的表達(dá)量最高;相關(guān)CYP基因在中華按蚊不同組織內(nèi)表達(dá)差異顯著,表現(xiàn)出明顯的富集性;CYP6M3基因與CYP12F16基因在馬氏管內(nèi)表達(dá)量分別是卵巢的38.9倍和4.4倍,CYP6Y1基因與CYP4G17基因在脂肪體內(nèi)表達(dá)量分別是卵巢的9.1倍與4.6倍,CYP6P5基因在中腸內(nèi)表達(dá)量是卵巢的30.3倍;接觸不同溴氰菊酯劑量和時(shí)間對相關(guān)CYP基因的表達(dá)水平表現(xiàn)出一定的誘導(dǎo)效應(yīng),在接觸不同溴氰菊酯劑量過程中,CYP6P5、CYPH14與CYP12F16基因隨著接觸劑量的增大表達(dá)水平逐漸增高,CYP6Y1基因表達(dá)水平先升高然后降低,CYP4G17基因表達(dá)水平先降低隨后升高;在接觸溴氰菊酯不同時(shí)間的過程中,抗性相關(guān)CYP基因表達(dá)水平變化隨時(shí)間(5-60min)變化多數(shù)呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢,且大多數(shù)基因表達(dá)水平均在30min處達(dá)到最大值。本部分研究內(nèi)容發(fā)現(xiàn)抗性相關(guān)CYP基因在中華按蚊不同發(fā)育時(shí)期以及不同組織內(nèi)表達(dá)差異顯著,且其表達(dá)水平在一些組織中表現(xiàn)出明顯的富集性�？剐韵嚓P(guān)CYP基因表達(dá)水平隨殺蟲劑接觸呈現(xiàn)一定的誘導(dǎo)效應(yīng),這些都進(jìn)一步提示CYP家族成員在中華按蚊溴氰菊酯抗性中發(fā)揮重要作用。
【學(xué)位單位】：江蘇省血吸蟲病防治研究所
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R384.1
【部分圖文】：

氰菊酯抗性的水平，為抗性機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)，本研究采用美國 CDC 生測定法對實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場中華按蚊樣本溴氰菊酯抗性水平進(jìn)行檢測。材料與方法 實(shí)驗(yàn)材料1 實(shí)驗(yàn)室中華按蚊樣本：為江蘇省血吸蟲病防治研究所媒介生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)品系，該實(shí)驗(yàn)室品系為江蘇無錫現(xiàn)場采集并傳代至今，在飼養(yǎng)過程中從觸過殺蟲劑。2 現(xiàn)場中華按蚊樣本：2017 年分別采集于江蘇省鹽城市（鹽都區(qū)大縱湖鎮(zhèn)村）、常州市（金壇區(qū)朱林鎮(zhèn)西洋圩村）和泰州市（高港區(qū)大泗鎮(zhèn)前進(jìn)村）個(gè)地區(qū)的稻田以及水渠（圖 1-1），將采集的 3 齡、4 齡中華按蚊幼蟲以及蚊回實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)羽化至成蚊。

第一部分 中華按蚊溴氰菊酯抗性水平檢測與分析（3）生物瓶的制備與保存：將儲(chǔ)備液稀釋至所需濃度，然后準(zhǔn)備五個(gè)干燥好的玻璃瓶，一個(gè)作為對照瓶，四個(gè)作為重復(fù)瓶，將每個(gè)瓶身與瓶蓋作對應(yīng)標(biāo)記，向?qū)φ掌恐屑尤?1ml 無水乙醇，蓋好蓋子，在其他四個(gè)測試瓶中，加入 1ml 溴氰菊酯溶液，旋轉(zhuǎn)玻璃瓶使溶液覆蓋玻璃瓶底部，倒轉(zhuǎn)玻璃瓶并旋轉(zhuǎn)以覆蓋瓶蓋的內(nèi)部，將瓶身平放，輕輕旋轉(zhuǎn)瓶體，使溶液覆蓋瓶壁，所有對照瓶和測試瓶均進(jìn)行此操作，然后取下瓶蓋，繼續(xù)滾動(dòng)玻璃瓶，直到液體消失至玻璃瓶完全干透，將玻璃瓶放在桌面上，蓋上遮光紙以保護(hù)其免受光照，待溶液完全干燥后避光保存?zhèn)溆茫▓D 1-2）。

蟲進(jìn)入生物瓶后將使瓶身平放，啟動(dòng)計(jì)時(shí)器，立刻檢查瓶內(nèi)蚊在觀測過程中，不斷滾動(dòng)瓶身并在標(biāo)準(zhǔn)記錄表要求時(shí)刻（分別為45，60，75，90，105，120 分鐘）記錄蚊蟲死亡數(shù)等數(shù)據(jù)。成身體翻轉(zhuǎn)、側(cè)歪不能運(yùn)動(dòng)或四肢可以輕微顫動(dòng)。據(jù)檢測結(jié)果計(jì)算蚊蟲死亡率，根據(jù)蚊蟲死亡率測定蚊蟲抗性水對照瓶中 2 小時(shí)的蚊蟲死亡率在 3％至 10％之間，使用 Abbo結(jié)果。如果在測試結(jié)束時(shí)對照瓶中的死亡率>10％，則放棄實(shí)在推薦診斷時(shí)間內(nèi)死亡率 98％-100％表示蚊蟲對殺蟲劑敏感內(nèi)死亡率 80％-97％表明有殺蟲劑抗性的可能性，推薦診斷時(shí)表明蚊蟲存在殺蟲劑抗性。bbott 校正公式.校正死亡率(%) =[測試瓶死亡率(%) 對照瓶死亡率(%)]100% 對照瓶死亡率(%)× 100%
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本文編號：2870570