發(fā)布時(shí)間：2020-11-04 12:26

　　 目的運(yùn)用高通量測(cè)序和生物信息學(xué)技術(shù)手段,分析與篩選新的可能參與細(xì)胞自噬調(diào)控的miR-129-3p;探究miR-129-3p通過靶向調(diào)控自噬相關(guān)基因Atg4b進(jìn)而影響細(xì)胞自噬以及結(jié)核分枝桿菌發(fā)生免疫逃避的機(jī)制。方法利用雷帕霉素和3-MA制備細(xì)胞自噬模型,采用高通量測(cè)序技術(shù)獲得miRNAs差異表達(dá)譜;利用miRWalk 3.0、DAVID、STRING等數(shù)據(jù)庫對(duì)miR-129-3p及其靶基因Atg4b做功能GO注釋、KEGG通路和蛋白互作功能分析。利用RT-qPCR檢測(cè)mi R-129-3p在自噬以及BCG感染細(xì)胞模型中的表達(dá)量。構(gòu)建pMIR-Report-Atg4b-WT/MUT載體;通過熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)、RT-qPCR、Western Blot等方法驗(yàn)證miR-129-3p對(duì)Atg4b的靶向調(diào)控作用。利用Western Blot檢測(cè)細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白LC3和p62的表達(dá)變化,激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)LC3在胞質(zhì)內(nèi)分布情況。最后通過CFU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-129-3p對(duì)BCG胞內(nèi)存活量的影響。結(jié)果1.經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),miR-129-3p的靶基因Atg4b具有很多與細(xì)胞自噬相關(guān)的功能,且涉及多條細(xì)胞自噬信號(hào)通路,據(jù)此作為研究對(duì)象。2.BCG感染RAW264.7細(xì)胞后,miR-129-3p表達(dá)量隨MOI增高而增加,提示miR-129-3p與BCG感染程度相關(guān)。MiR-129-3p的表達(dá)量隨時(shí)間延長(zhǎng)而升高,在12小時(shí)達(dá)到最大值,隨后有所下降。說明miR-129-3p在結(jié)核分枝桿菌感染早期發(fā)揮作用,隨后會(huì)被細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)反饋調(diào)節(jié)。3.雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-129-3p mimic可以顯著抑制pMIR-Report-Atb4bWT組的熒光素酶活性,miR-129-3p antagomir可以增強(qiáng)熒光素酶活性。而在pMIR-Report-Atb4b-Mut組中,熒光素酶活性沒有變化。說明miR-129-3p可以靶向結(jié)合Atg4b的3’非翻譯區(qū)抑制其表達(dá)。同時(shí),qRT-PCR結(jié)果顯示mi R-129-3p mimic可以抑制Atg4b mRNA表達(dá)水平,antagomir可以提高Atg4b mRNA表達(dá)量;Western Blot結(jié)果表明miR-129-3p mimic可以降低Atg4b蛋白表達(dá)量,miR-129-3p antagomir可以提高Atg4b表達(dá)量。這說明miR-129-3p可以在轉(zhuǎn)錄水平靶向調(diào)控Atg4b的表達(dá)。4.Western Blot結(jié)果顯示,miR-129-3p過表達(dá)可以抑制Atg4b和LC3I表達(dá),p62蛋白集聚增多;miR-129-3p antagomir可以提高Atg4b、LC3I和LC3II的表達(dá),增加p62蛋白的降解導(dǎo)致其含量降低。免疫熒光結(jié)果顯示miR-129-3p mimic使LC3均分布在細(xì)胞質(zhì)中,miR-129-3p antagomir可以使LC3點(diǎn)狀聚集增多。說明miR-129-3p可以抑制自噬體形成,抑制細(xì)胞自噬水平。5.CFU結(jié)果表明,mi R-129-3p mimic可以增加BCG的胞內(nèi)存活量,相反,mi R-129-3p antagomir可以降低BCG的胞內(nèi)存活。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的與細(xì)胞自噬相關(guān)的miRNA:miR-129-3p。并且證明miR-129-3p可以靶向抑制自噬相關(guān)蛋白Atg4b來調(diào)控自噬小體的生成,進(jìn)而影響細(xì)胞自噬水平,促進(jìn)胞內(nèi)寄生BCG的存活,對(duì)探究MTB潛伏感染和免疫逃避具有重要作用。
【學(xué)位單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R392
【文章目錄】：
摘要
abstract
前言
第一部分 miR-129-3p及其靶基因的生物信息學(xué)分析
    材料與方法
    實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    討論
第二部分 巨噬細(xì)胞自噬模型和結(jié)核分枝桿菌病感染模型中miR-129-3p的表達(dá)量的檢測(cè)
    材料與方法
    實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    討論
第三部分 miR-129-3p靶基因Atg4b載體構(gòu)建及其靶向關(guān)系的驗(yàn)證
    材料與方法
    實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    討論
第四部分 miR-129-3p負(fù)向調(diào)控Atg4b抑制細(xì)胞自噬并促進(jìn)胞內(nèi)寄生BCG的存活
    材料與方法
    實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
    綜述參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
個(gè)人簡(jiǎn)歷
開題、中期及學(xué)位論文答辯委員組成

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本文編號(hào)：2870099