腹腔鏡手術(shù)創(chuàng)口小、疼痛輕、術(shù)后恢復(fù)快,其安全性、可行性在肝臟外科中已經(jīng)驗(yàn)證。然而,腹腔鏡肝切除手術(shù)同樣會(huì)發(fā)生肝臟缺血再灌注損傷,有效防止肝臟缺血再灌注損傷是肝臟外科領(lǐng)域亟待解決的問題。肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)性研究多數(shù)局限于兔、鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,目前的模型還不能完全模擬腹腔鏡手術(shù)操作環(huán)境,建立腹腔鏡環(huán)境下肝損傷模型是進(jìn)行深入研究的前提。氫氣是一種天然的抗氧化劑,可選擇性清除氧自由基,對組織器官具有保護(hù)作用。因此,本課題建立小型豬腹腔鏡肝臟缺血再灌注合并肝部分切除損傷模型,探究富氫生理鹽水(HRS)對術(shù)后肝細(xì)胞凋亡的影響。本研究隨機(jī)將18頭小型豬分為假手術(shù)組(Sham組)、模型組(IRI組)、HRS干預(yù)組(HRS組)。Sham組僅建立手術(shù)通路、氣腹、翻動(dòng)肝葉;IRI組建立右半肝缺血60 min合并左半肝切除損傷模型;HRS組手術(shù)操作同IRI組并通過肝門靜脈于再灌注前10 min、術(shù)后1 d、2 d、3 d注射HRS(10 mL/kg)。分別在術(shù)前、術(shù)后即刻、1 d、3 d、7 d采集肝組織樣本和血液樣本。試劑盒檢測肝功能指標(biāo)的變化,實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western Blot技術(shù)檢測Bax、Bcl-2、Fas、Fasl mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)量,試劑盒檢測肝組織中Caspase-3、8、9活性,TUNEL法測定肝細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI),透射電鏡觀察肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。本研究順利地完成各組手術(shù),術(shù)后恢復(fù)良好。(1)肝功能檢測結(jié)果:與Sham組比較,IRI組和HRS組術(shù)后即刻、1 d、3 d ALT、AST水平明顯升高(P0.05或P0.01),術(shù)后1 d、3 d TBIL水平明顯升高(P0.01);HRS組與IRI組比較,術(shù)后1 d、3 d ALT、TBIL水平明顯降低(P0.05或P0.01),術(shù)后即刻、1 d、3 d AST水平明顯降低(P0.05或P0.01)。(2)肝細(xì)胞凋亡指數(shù)結(jié)果:與Sham組比較,IRI組和HRS組術(shù)后即刻、1 d、3 d凋亡指數(shù)明顯增加(P0.05或P0.01);HRS組與IRI組比較,術(shù)后1 d、3 d凋亡指數(shù)明顯降低(P0.05)。(3)肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化:與Sham組比較,IRI組和HRS組肝組織超微結(jié)構(gòu)變化明顯,HRS組損傷程度較IRI組減輕。(4)凋亡相關(guān)因子mRNA轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)結(jié)果:與Sham組比較,IRI組和HRS組術(shù)后即刻、1 d Bax mRNA轉(zhuǎn)錄量和蛋白表達(dá)量明顯升高(P0.05或P0.01),Bcl-2 mRNA轉(zhuǎn)錄量和蛋白表達(dá)量明顯降低(P0.05或P0.01),在術(shù)后即刻、1 d、3 d Bax/Bcl-2 mRNA比值或蛋白比值明顯升高(P0.05或P0.01);HRS組與IRI組比較,術(shù)后即刻、1 d Bax mRNA轉(zhuǎn)錄量和蛋白表達(dá)量明顯降低(P0.05或P0.01),Bcl-2 mRNA轉(zhuǎn)錄量和蛋白表達(dá)量明顯升高(P0.05或P0.01),Bax/Bcl-2 mRNA比值或蛋白比值明顯降低(P0.01)。與Sham組比較,IRI組和HRS組術(shù)后即刻、1 d Fas mRNA轉(zhuǎn)錄量和蛋白表達(dá)量明顯升高(P0.05或P0.01),術(shù)后1 d、3 d Fasl mRNA轉(zhuǎn)錄量和蛋白表達(dá)量明顯升高(P0.05或P0.01);HRS組與IRI組比較,術(shù)后1 d、3 d Fas mRNA轉(zhuǎn)錄量和蛋白表達(dá)量明顯降低(P0.05或P0.01),術(shù)后1 d、3 d Fasl mRNA轉(zhuǎn)錄量和蛋白表達(dá)量明顯降低(P0.05)。(5)Caspase活性檢測結(jié)果:與Sham組比較,IRI組術(shù)后1 d、3 d Caspase-3、8、9活性明顯升高(P0.01),HRS組術(shù)后1 d Caspase-3、9活性明顯升高(P0.01);HRS組與IRI組比較,術(shù)后1 d、3 d Caspase-3、8活性明顯降低(P0.05或P0.01),術(shù)后即刻、1d Caspase-9活性明顯降低(P0.05或P0.01)。綜上所述,得出下列結(jié)論:(1)HRS可促進(jìn)術(shù)后肝功能的恢復(fù),對小型豬腹腔鏡肝臟缺血再灌注合并肝部分切除損傷具有保護(hù)作用。(2)HRS可減少小型豬腹腔鏡肝臟缺血再灌注合并肝部分切除損傷中肝細(xì)胞凋亡的數(shù)目,具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。(3)在小型豬腹腔鏡肝臟缺血再灌注合并肝部分切除損傷中,HRS通過下調(diào)Bax、Fas、Fasl mRNA和蛋白表達(dá),升高Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá),并通過降低Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性,發(fā)揮其抑制細(xì)胞凋亡的作用。
【學(xué)位單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R657.3;R-332
【部分圖文】：

圖 2-1 手術(shù)通路的建立Fig. 2-1 Establishment of operation pathway法 60 min分離斷肝臟左右三角韌帶、肝圓韌帶、鐮狀韌離鉗和左彎分離鉗使肝實(shí)質(zhì)與膽囊管、膽囊動(dòng)實(shí)質(zhì)中間穿過一根自制帶針止血帶，同時(shí)貫穿基部（如圖 2-3）；停止右半肝供血 60 min(如圖肝血流同時(shí)實(shí)施左半肝切除。管半肝缺血期間將中央靜脈導(dǎo)管插入門靜脈。在第靜脈穿刺導(dǎo)管順入腹腔，用空心注射器將肝素生，確定合適的穿刺位點(diǎn)（盡量靠近遠(yuǎn)心端）并刺端順入導(dǎo)絲，成功將導(dǎo)絲進(jìn)入肝門靜脈 4 cm 左穿刺導(dǎo)管。將 16 G 中心靜脈導(dǎo)管順著導(dǎo)絲送退出導(dǎo)絲（如圖 2-6），調(diào)整導(dǎo)管在腹腔內(nèi)的長適度。體外連接好導(dǎo)管接頭和肝素帽，向?qū)Ч?

材料與方法割線離斷肝實(shí)質(zhì)（如圖 2-9），將整個(gè)左半肝全部切除，切除后檢查斷面有無出血點(diǎn)（如圖10）。用電凝球?qū)嗝鏉B血處止血。（4）離斷肝葉的取出腹腔內(nèi)用術(shù)前準(zhǔn)備的溫生理鹽水沖洗后，通過 10 mm 套管把消毒處理的樣本袋送入腹腔，將離斷的左半肝組織、止血帶及雙孔卡扣放進(jìn)樣本袋內(nèi)，擴(kuò)大腹壁切口，將樣本袋取出（5）縫合切口在腹底 10 mm 套管處置入 1 根腹腔引流管，體外固定。腹壁切口常規(guī)縫合并用碘酊消毒（6）HRS 注射時(shí)間點(diǎn)HRS 干預(yù)組分別在再灌注前 10 min、術(shù)后 1 d、2 d、3 d 經(jīng)門靜脈中心靜脈導(dǎo)管注射 HR10 mL/kg）。

材料與方法割線離斷肝實(shí)質(zhì)（如圖 2-9），將整個(gè)左半肝全部切除，切除后檢查斷面有無出血點(diǎn)（如圖10）。用電凝球?qū)嗝鏉B血處止血。（4）離斷肝葉的取出腹腔內(nèi)用術(shù)前準(zhǔn)備的溫生理鹽水沖洗后，通過 10 mm 套管把消毒處理的樣本袋送入腹腔，將離斷的左半肝組織、止血帶及雙孔卡扣放進(jìn)樣本袋內(nèi)，擴(kuò)大腹壁切口，將樣本袋取出（5）縫合切口在腹底 10 mm 套管處置入 1 根腹腔引流管，體外固定。腹壁切口常規(guī)縫合并用碘酊消毒（6）HRS 注射時(shí)間點(diǎn)HRS 干預(yù)組分別在再灌注前 10 min、術(shù)后 1 d、2 d、3 d 經(jīng)門靜脈中心靜脈導(dǎo)管注射 HR10 mL/kg）。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2870286