發(fā)布時間：2020-11-01 06:47

　　 目的 本研究旨在關(guān)注Survivin過表達(dá)載體對MS1細(xì)胞的部分生物學(xué)特性的影響，擬對轉(zhuǎn)染后的MS1細(xì)胞測其細(xì)胞凋亡及核酸蛋白的影響。方法 1.研究對象為小鼠胰島內(nèi)皮細(xì)胞（MS1細(xì)胞）。 2.據(jù)GenBank提供的基因序列，構(gòu)建含Survivin基因的質(zhì)粒載體。 3.培養(yǎng)MS1細(xì)胞，以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，設(shè)計分組：空白對照組（A組）、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染對照組（B組）、空質(zhì)粒組（C組）、實(shí)驗(yàn)組（D組pcDNA3.1-Survivin-V5-IRES-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞）。 4.通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率的變化。 5.Real time PCR測Survivin mRNA表達(dá)水平；Western blot測細(xì)胞survivin蛋白的表達(dá)量。 結(jié)果 1.經(jīng)測序鑒定，重組質(zhì)粒表達(dá)載體中目的基因片段及插入方向正確； 2.脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染MS1細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光。 3.Real time PCR證實(shí)MS1細(xì)胞中survivin微量表達(dá)或極低表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組較對照組增加約124倍。 4.Western blot結(jié)果證實(shí)了對照組survivin蛋白表達(dá)微量，轉(zhuǎn)染的MS1細(xì)胞survivin蛋白量明顯增加。 5.流式細(xì)胞術(shù)檢測，細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率為20%，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率（6.04±0.12）％,低于空白對照組（6.69±0.34）％,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染對照組（6.30±0.23）％，空質(zhì)粒組（6.53±0.46）％，有明顯差異（P﹤0.05）。 結(jié)論 1.成功構(gòu)建含survivin基因的重組質(zhì)粒真核表達(dá)載體。 2. survivin基因表達(dá)載體可明顯提高M(jìn)S1細(xì)胞內(nèi)Survivin mRNA及蛋白的表達(dá)。 3.survivin基因表達(dá)載體可降低細(xì)胞凋亡率，為后期將高表達(dá)survivin的MS1細(xì)胞接種于動物實(shí)驗(yàn)奠定了一定的理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2012
【中圖分類】：R363
【部分圖文】：

圖 1.Survivin 基因合成Fig1 synthesis of survivin gene（1）分析并檢查所需合成基因，注意基因內(nèi)的特別復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)和重復(fù)序列；（2）據(jù)分析基因序列的結(jié)果，應(yīng)用 oligo 軟件行單鏈 oligo 的設(shè)計及合成；（3） 通過 PCR 拼接合成的 oligo 為完整的基因；（4） pMD-18T 載體與合成的基因序列連接并轉(zhuǎn)化；（5） 重組克隆中基因序列測序驗(yàn)證。（6）若基因序列存在突變點(diǎn)，則由重疊 PCR 修復(fù)；（7）含有正確目的基因的 T 載體質(zhì)粒編號為 v394-7。1.3.2 pcDNA3.1-Survivin-V5-IRES-EGFP 表達(dá)載體的構(gòu)建

圖 2.pcDNA3.1-Survivin-V5-IRES-EGFP 質(zhì)粒載體構(gòu)建圖Fig2. pcDNA3.1-Survivin-V5-IRES-EGFP plasmid vector construction 1.3.2.1 序列拼接(1)設(shè)計目的基因 survivin-IRES2-EGFP 的 PCR 拼接引物。引物序列酶切位點(diǎn)，上游為 NheI，下游為 NotI；綠色為 PCR 拼接引物重疊區(qū)引物 1 5'-ATTATTGCTAGCGCCACCATGGGAGCTCCGGCGCTGC-引物 2 5'-TAGGGGGGGGGGAGGGAGAGGGGCGGATCCTTAGGCCTGCTCAATTG-3'引 物物 35'-CGTCAGTCAATTGAGCAGCTGGCTGCCTAAGGATCCGTCCCTC-3'引物 4 5'-ATTATTGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC

1: surviving 2: IRES2-EGFP 3: marker圖 3 PCR 擴(kuò)增小鼠 survivin 基因及 IRES2-EGFP 電泳圖Fig3 Electropherogram of PCR amplificating survivi2.2 將目的基因 survivin 片段與 IRES2-EGFP 進(jìn)行 PCR 拼將目的基因survivin片段與IRES2-EGFP進(jìn)行PCR拼接，得重組片段，擴(kuò)增產(chǎn)物在 1.0%瓊脂糖凝膠電泳中呈現(xiàn)一 200的片段 survivin438bp 和 IRES2-EGFP 1500bp 大小，說明
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2865170