目的:通過回輸過表達細胞因子信號傳導抑制蛋白1(SOCS1)的DCs到小鼠體內,并觀察小鼠慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型支氣管肺泡灌洗液(BALF)中輔助性T細胞17(Th17)、調節(jié)性T細胞(Treg)相關細胞因子的變化,進一步探討COPD的發(fā)病機制,為COPD尋找治療靶點。方法:體外培養(yǎng)DCs并鑒定其表型、形態(tài)。構建SOCS1過表達慢病毒,轉染培養(yǎng)第5天未成熟DCs(imDCs)獲得SOCS1過表達DCs,使用蛋白印跡法(Western blot)檢測SOCS1在DCs內的表達情況,并將轉染的細胞以尾靜脈注射法回輸到小鼠體內;42只C57BL/6小鼠隨機分成7個組,每組6只,分別是生理鹽水(NS)、im DC 1×10~6、DC-SOCS11×10~6、DC-SOCS1 2×10~6煙熏造模第1天回輸組、imDC 1×10~6、DC-SOCS1 1×10~6、DC-SOCS1 2×10~6煙熏造模第7天回輸組。使用煙熏法建立COPD小鼠模型至實驗第4周(28天)最后一次煙熏完后處死七組小鼠,并收集小鼠BALF。收集的BALF予以離心取上清液用于酶聯免疫吸附劑測定(ELISA)檢測Th17、Treg相關細胞因子的變化。結果:1、體外培養(yǎng)小鼠骨髓源性DCs,流式細胞術檢測第7天脂多糖(LPS)誘導后DCs細胞有較高的CD80、CD83表達;應用掃描電鏡觀察第7天LPS誘導后DCs表面有明顯眾多的褶皺和樹枝樣突起。2、使用Western blot檢測陽性轉染組SOCS1的表達高于陰性轉染組及空白組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。3、第1天、第7天imDC 1×10~6、DC-SOCS1 1×10~6及DC-SOCS1 2×10~6回輸組與第1天NS回輸組相比,小鼠COPD模型BALF中白介素-17(IL-17)、IL-23含量降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01);第1天、第7天DC-SOCS1 1×10~6、DC-SOCS1 2×10~6回輸組分別與imDC 1×10~6回輸組比較BALF中IL-17、IL-23含量降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01);DC-SOCS1 2×10~6回輸組與DC-SOCS1 1×10~6回輸組相比,BALF中IL-17、IL-23含量降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01);DC-SOCS11×10~6第7天回輸組小鼠BALF中IL-17的含量較第1天回輸組增高,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),IL-23含量增高差異有統(tǒng)計學意義(P0.01);DC-SOCS12×10~6煙熏第7天回輸組小鼠BALF中IL-17、IL-23的含量較第1天回輸組增高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。4、第1天、第7天imDC 1×10~6、DC-SOCS1 1×10~6及DC-SOCS1 2×10~6回輸組與第1天NS回輸組相比,BALF中IL-10、轉換生長因子-β(TGF-β)含量增高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01);第1天、第7天DC-SOCS1 2×10~6回輸組與DC-SOCS11×10~6回輸組相比,BALF中IL-10、TGF-β含量增高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01);DC-SOCS1 1×10~6第7天回輸組小鼠BALF中IL-10、TGF-β的含量較第1天回輸組減少,差異有統(tǒng)計學意義(分別為P0.05、P0.01),DC-SOCS1 2×10~6煙熏第7天回輸組小鼠BALF中IL-10、TGF-β的含量較第1天回輸組減少,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。結論:1、im DCs回輸小鼠體內可抑制COPD中Th17相關細胞因子分泌。2、SOCS1過表達的DCs回輸小鼠體內后可抑制COPD中以Th17為主的免疫反應,效果優(yōu)于單純回輸imDCs,且與濃度、時間有關,提示合適濃度、提前干預可能更早抑制COPD中以Th17為主的免疫反應,為COPD治療提供新的靶點。
【學位單位】：遵義醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R563.9;R-332
【部分圖文】：

內容頸椎脫臼法處死后立即用 75%乙醇浸泡，移入超凈工作臺面的泡沫板上，分離出小鼠股骨和脛骨，剔用 1mL 無菌注射器吸 PBS 沖洗骨髓直至骨髓腔變白，棄上清。用 PBS 重懸細胞沉淀。緩慢將細胞懸液 15mL 離心管內，保持細胞懸液在淋巴細胞分離液上心 20min，離心后溶液分 5 層，吸取中間骨髓基質血清及青鏈霉素的 DC 細胞生長培養(yǎng)基以 106/mL 細小鼠 GM-CSF(25ng/mL) 和 IL-4(25ng/mL)進行誘養(yǎng)。每天觀察細胞生長狀態(tài)，培養(yǎng)第 7 天加入 LPS

圖 2 pLVX-IRES-ZsGreen1 載體圖譜信息I 對 pLVX-IRES-ZsGreen1 載體進行酶試劑盒回收 pLVX-IRES-ZsGreen 載F 序列合成5μl 2μg1μl1μlup to 50μl

3 EcoRI 和 BamHI 雙酶切鑒定圖ne 2:1# Plasmid Digested with EcoRI/Ba大量抽提的菌液送測序，并將剩余的（見圖 4），正確無誤后，用得到足夠多的重組質粒進行
【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 ;Dendritic Cells Transduced with SOCS1 Gene Exhibit Regulatory DC Properties and Prolong Allograft Survival[J];Cellular & Molecular Immunology;2009年02期

本文編號：2862472