目的:研究煙堿型乙酰膽堿受體在在面神經(jīng)支配的口輪匝肌和軀體神經(jīng)支配的腓腸肌運動終板處的表達差異及可能的原因。方法:分離SD大鼠的口輪匝肌和腓腸肌,通過免疫共沉淀技術(shù)計算口輪匝肌和腓腸肌肌肉特異性激酶(Muscle Specific Kinase,Mu SK)的表達以及MuSK磷酸化水平。對MuSK的上游信號通路中能使其發(fā)生磷酸化的集聚蛋白Agrin、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白4 (low-density lipoprotein receptor-related protein 4, Lrp4)以及表皮生長因子家族受體ErbB2、ErbB3和ErbB4(epidermal growth factor receptor)免疫熒光染色,計算這兩條不同通路中的蛋白在運動終板處的表達水平。結(jié)果:口輪匝肌中MuSK磷酸化水平顯著高于腓腸肌(P0.05)�？谳喸鸭∨c腓腸肌的運動終板處的Agrin和Lrp4表達沒有顯著差異(P0.05)�？谳喸鸭rbB2、ErbB3、ErbB4的表達顯著高于其在腓腸肌運動終板處的表達(P0.01)。結(jié)論:口輪匝肌和腓腸肌運動終板ErbB、ErbB3、ErbB4的差異表達造成MuSK磷酸化水平不同,可能是兩種肌肉運動終板處煙堿型乙酰膽堿亞基表達量不同的原因。
【部分圖文】：

利用免疫共沉淀技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)在100 kD條帶的位置，MuSK在兩種肌肉中的表達并無差異。然而通過計算4G10（磷酸化的MuSK）條帶的強度與MuSK條帶強度的比值，得出口輪匝肌中MuSK磷酸化程度高于腓腸肌中MuSK磷酸化水平(63.7%±2.26-45.3%±3.27,P<0.05,n=20)。結(jié)果見圖1。2.2 口輪匝肌和腓腸肌中運動終板處Agrin、Lrp4和MuSK的表達比較

對腓腸肌和口輪匝肌運動終板處的Agrin,Lrp4和MuSK進行熒光染色。α-BTX（α-bungarotoxin）是一種銀環(huán)蛇毒素，可以特異性結(jié)合nAchRs的α1亞基，用于標(biāo)記運動終板。Agrin在口輪匝肌中運動終板的熒光密度(0.07959±0.005334)與腓腸肌(0.08235±0.004976)中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,n=20),Lrp4(0.04213±0.002265-0.04122±0.002043)和MuSK(0.04829±0.002214-0.04267±0.002098)也無顯著差異(P>0.05,n=20)，結(jié)果見圖2。2.3 口輪匝肌和腓腸肌中運動終板處ErbB2,ErbB3和ErbB4的表達

在胚胎發(fā)育過程中，肌肉會預(yù)先選定運動終板位置，并引導(dǎo)神經(jīng)末梢的的生長，最終形成完整的突觸的結(jié)構(gòu)，而表達于肌細胞膜上的MuSK蛋白在這一過程中起決定性的作用。在MuSK突變的的肌管和小鼠胚胎中，運動終板的突觸前和突觸后的的正常結(jié)構(gòu)都無法形成。MuSK在體外培養(yǎng)的成肌細胞中以低水平表達，同時動物實驗證明在胚胎早期，MuSK特異性表達于發(fā)育中的肌肉，但MuSK的水平在成熟肌肉中卻顯著下降，僅在神經(jīng)肌肉接頭處的表達和分布[20]。突觸后膜nAchRs的形成和聚集是運動終板成熟的標(biāo)志，這一過程和MuSK表達和被激活發(fā)生磷酸化息息相關(guān)[21,22]。在MuSK基因敲除小鼠或從突變體提取和培養(yǎng)的肌管中，nAChRs不能在運動終板處聚集，甚至失去了突觸特異性nAChRs表達和轉(zhuǎn)錄能力。然而，MuSK對于n AChRs聚集的能力依賴于其近膜區(qū)的酪氨酸磷酸化修飾，當(dāng)特異性的抑制MuSK的這段近膜區(qū)的功能后，突觸后膜失去了nAchRs表達和聚集的能力[23,24]。為了探討nAchRs在口輪匝肌和腓腸肌運動終板處的表達差異的原因，根據(jù)以上我們對Mu SK在運動終板形成和成熟的中作用的認(rèn)識，我們首先分析了口輪匝肌和腓腸肌運動終板的MuSK表達量，同時評估了Mu SK的磷酸化水平。結(jié)果顯示了在兩種肌肉運動終板處的Mu SK的表達水平?jīng)]有差異，而MuSK的磷酸化水平有顯著差異，提示MuSK在兩種肌肉中被不同程度的激活。為了尋找MuSK磷酸化水平的差異的原因，我們探究了能促使MuSK發(fā)生磷酸化的上游因子的表達水平。在運動終板處，由運動神經(jīng)元分泌的Agrin，是一種肝素硫酸酯類糖蛋白分子。Agrin通過與突觸后膜Lrp4結(jié)合，激活MuSK近膜區(qū)的Y533位的酪氨酸發(fā)生磷酸化，促進MuSK對nAchR在突觸后膜表達和聚集的作用，最終實現(xiàn)突觸后膜nAchRs的表達和聚集[20,25,26]。失去Agrin和Lrp4的作用，突觸后膜MuSK磷酸化的水平顯著降低，而且突觸后膜nAchRs的表達和聚集也被抑制[27]。鑒于Agrin和Lrp4對MuSK有激活的作用，我們檢測了口輪匝肌和腓腸肌運動終板處的Agrin和Lrp4的表達。然而，我們并沒有發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白在口輪匝肌和腓腸肌運動終板的表達有顯著差異，這說明了口輪匝肌運動終板處MuSK相對高的磷酸化水平的原因并不是來自Agrin和Lrp4的表達。
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