血吸蟲(chóng)病是一種嚴(yán)重危害人民身心健康的人獸共患寄生蟲(chóng)性傳染病,在我國(guó)仍然是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。流行病學(xué)調(diào)查和人工感染實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明：東方田鼠Microtus fortis)是日本血吸蟲(chóng)的非適宜宿主,也是唯一一種對(duì)日本血吸蟲(chóng)具有天然抗性、感染血吸蟲(chóng)后不致病的哺乳動(dòng)物。在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,本研究通過(guò)藍(lán)色瓊脂糖凝膠親和層析,直接從東方田鼠血清中分離、純化獲得了一個(gè)對(duì)日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)具有顯著殺傷作用的蛋白——白蛋白。為了進(jìn)一步了解東方田鼠血清白蛋白抗日本血吸蟲(chóng)的作用機(jī)理,我們用FITC標(biāo)記東方田鼠血清白蛋白,來(lái)追蹤其在日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)體內(nèi)的作用部位,應(yīng)用日本血吸蟲(chóng)腸道內(nèi)的組織蛋白酶Legumain來(lái)消化東方田鼠血清白蛋白,并構(gòu)建了東方田鼠血清白蛋白的真核表達(dá)載體,制備條件培養(yǎng)基,驗(yàn)證了其表達(dá)產(chǎn)物對(duì)日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)的殺傷效果。 ILKAP是本課題組從東方田鼠骨髓細(xì)胞cDNA文庫(kù)中篩選出來(lái)的一種抗性基因,本研究利用東方田鼠骨髓蛋白與日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)蛋白通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),聯(lián)合MALDI-TOF-MS分析,鑒定出與ILKAP作用的8種相關(guān)蛋白,接著將基因ILKAP和Tegument antigen (TA)分別克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1/myc-His(-)b和pCMV-Tag2b,共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后,通過(guò)免疫共沉淀和Western blotting驗(yàn)證了ILKAP和Tegument antigen的相互作用,為進(jìn)一步闡明其在抗日本血吸蟲(chóng)的作用機(jī)制及發(fā)現(xiàn)新的抗性相關(guān)蛋白提供線索。 一、東方田鼠血清白蛋白的分離、純化、鑒定及對(duì)日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)的殺傷效果 實(shí)驗(yàn)通過(guò)藍(lán)色瓊脂糖凝膠層析柱分離得到東方田鼠血清白蛋白溶液,透析、冷凍干燥后,通過(guò)10%SDS-PAGE電泳進(jìn)行分析。將純化的白蛋白與體外培養(yǎng)的日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)共孵育,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：東方田鼠白蛋白濃度為2.5mg/m1時(shí),童蟲(chóng)死亡率為37.94%(P0.05),隨著白蛋白濃度的增加,童蟲(chóng)死亡率也增加,與對(duì)照組相比,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 二、東方田鼠血清白蛋白條件培養(yǎng)基的制備及對(duì)日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)的殺傷效果 本實(shí)驗(yàn)將東方田鼠白蛋白基因重組到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+),制備東方田鼠白蛋白的條件培養(yǎng)基,檢測(cè)其真核表達(dá)產(chǎn)物體外殺傷日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：東方田鼠albumin的條件培養(yǎng)基殺蟲(chóng)率為38.7%(P0.05),與對(duì)照組相比具有顯著的殺蟲(chóng)效果。 三、東方田鼠血清白蛋白在日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)體內(nèi)的定位及Legumain對(duì)東方田鼠血清白蛋白的消化 將熒光素(FITC)標(biāo)記的東方田鼠血清白蛋白與日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)共孵育,白蛋白終濃度為5mg/ml,于37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)童蟲(chóng)。24h及48h后分別收獲童蟲(chóng),于OLYMPUS倒置熒光顯微鏡下觀察熒光出現(xiàn)的部位。結(jié)果發(fā)現(xiàn),FITC標(biāo)記的東方田鼠血清白蛋白與日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)共孵育24h后,在童蟲(chóng)腸道內(nèi)有熒光素聚集,孵育48h后,熒光素在童蟲(chóng)腸道內(nèi)的聚集更加明顯。 為了進(jìn)一步了解東方田鼠抗日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)的作用機(jī)制,我們分析了日本血吸蟲(chóng)腸道內(nèi)常見(jiàn)的幾種內(nèi)肽酶：組織蛋白酶B、組織蛋白酶D、組織蛋白酶L和組織蛋白酶AE。通過(guò)文獻(xiàn)資料查閱和序列分析發(fā)現(xiàn)：只有Legumain對(duì)東方田鼠和小白鼠白蛋白的氨基酸序列有切割位點(diǎn)的變化。因此我們利用Legumain分別消化東方田鼠和小白鼠血清白蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Legumain對(duì)東方田鼠和小白鼠血清白蛋白的消化存在顯著差異。 四、與ILKAP相互作用的日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)蛋白的篩選 在早期抗日本血吸蟲(chóng)研究中,課題組建立了東方田鼠骨髓細(xì)胞cDNA文庫(kù),通過(guò)表達(dá)克隆法對(duì)該文庫(kù)進(jìn)行抗性基因的篩選,從gE77次級(jí)亞基因池中篩選到抗性候選基因gE77.43,其編碼的產(chǎn)物為整合素連接激酶相關(guān)絲氨酸／蘇氨酸磷酸酶(ILKAP)。前期研究首次發(fā)現(xiàn)ILKAP具有顯著的殺傷日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)的效果。因此,本研究利用東方田鼠骨髓蛋白與日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)蛋白,通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),聯(lián)合質(zhì)譜分析鑒定與8種與ILKAP相互作用的血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)蛋白質(zhì)。 五、與ILKAP相互作用的日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)蛋白的驗(yàn)證 東方田鼠骨髓蛋白與日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)蛋白通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜分析共篩選了8個(gè)可能與ILKAP相互作用的血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)蛋白質(zhì)。為進(jìn)一步驗(yàn)證篩選出來(lái)的蛋白質(zhì)是否與ILKAP存在相互作用,本實(shí)驗(yàn)采用免疫共沉淀結(jié)合Western blotting發(fā)現(xiàn)童蟲(chóng)蛋白TA確實(shí)與ILKAP存在直接相互作用。本研究利用脂質(zhì)體分別將Myc-TA-pcDNA3.1/(-)b和Flag-ILKAP-pCMV-2b轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞,建立ILKAP-Flag和TA-Myc高表達(dá)的HEK293T細(xì)胞；通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)了日本血吸蟲(chóng)蛋白TA與東方田鼠骨髓ILKAP之間的相互作用,為進(jìn)一步闡明東方田鼠抗日本血吸蟲(chóng)的作用機(jī)制及發(fā)現(xiàn)新的靶作用位點(diǎn)提供線索。
【學(xué)位單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2014
【中圖分類】：R383.24
【部分圖文】：

1東方田鼠白蛋白的分離、純化及對(duì)日本血吸蟲(chóng)的殺傷效果洗脫曲線如圖1-1。圖示結(jié)果顯示目的峰與前鋒分離徹底，呈拋物線，且無(wú)脫尾現(xiàn)象和其他雜峰，表明透析處理后的血清經(jīng)藍(lán)色瓊脂糖親和層析后，分離效果好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。SDS-PAGE分析處理后的白蛋白純度，如圖1-2,圖示結(jié)果顯示PAGE膠中只有單一的一條帶，進(jìn)一步表明處理后的血清經(jīng)藍(lán)色瓊脂糖親和層析后純度較高，幾乎無(wú)其他蛋白質(zhì)干擾。r -* ..……”￡-： ..二 ? _ 地. ~ ~.J—,.： — ."niy.',-.' ‘ "".'.fjiii' --- 二二,i■二 ???——v-?- ..一，…士-I-.””"十■- 1‘ T III丨.11: '? ■■■—“-圓 I三 =: J _2 r "”二：. -二 …：二 ‘.卜:-‘V —"T. B?. z I 1 ■*- -. 一- ."3~ ~ 1 \ . . 3 \ “ -- \：二:l^ ： “ "一 “ - * “‘ \ -5?-,^ ._:J— _ = ^ ^圖1-1藍(lán)色球脂糖凝膠FF親和色譜分離東方田鼠血清白蛋白的洗股圖Fig. 1-1 Elution profile of A^Tserum albumin with Blue Sepharose FF affinity chromatographicfractionation1:球蛋白 2:白蛋白1: A^serum globulin, 2: A/f serum albuminm PMT,； -1”'-1 OQ 70 巧.：50——nil35——25七難圖1-2親和層析純化后白蛋白的SDS-PAGE圖Fig. 1-2 SDS-PAGE of j\^semm albumin purified with Blue Sepharose FF affinitychromatographyM:寬范圍蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)1:東方田鼠血清白蛋白Lane M: Broad range protein molecular weight marker (100 kD, 70 kD，50 kD

現(xiàn)象和其他雜峰，表明透析處理后的血清經(jīng)藍(lán)色瓊脂糖親和層析后，分離效果好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。SDS-PAGE分析處理后的白蛋白純度，如圖1-2,圖示結(jié)果顯示PAGE膠中只有單一的一條帶，進(jìn)一步表明處理后的血清經(jīng)藍(lán)色瓊脂糖親和層析后純度較高，幾乎無(wú)其他蛋白質(zhì)干擾。r -* ..……”￡-： ..二 ? _ 地. ~ ~.J—,.： — ."niy.',-.' ‘ "".'.fjiii' --- 二二,i■二 ???——v-?- ..一，…士-I-.””"十■- 1‘ T III丨.11: '? ■■■—“-圓 I三 =: J _2 r "”二：. -二 …：二 ‘.卜:-‘V —"T. B?. z I 1 ■*- -. 一- ."3~ ~ 1 \ . . 3 \ “ -- \：二:l^ ： “ "一 “ - * “‘ \ -5?-,^ ._:J— _ = ^ ^圖1-1藍(lán)色球脂糖凝膠FF親和色譜分離東方田鼠血清白蛋白的洗股圖Fig. 1-1 Elution profile of A^Tserum albumin with Blue Sepharose FF affinity chromatographicfractionation1:球蛋白 2:白蛋白1: A^serum globulin, 2: A/f serum albuminm PMT,； -1”'-1 OQ 70 巧.：50——nil35——25七難圖1-2親和層析純化后白蛋白的SDS-PAGE圖Fig. 1-2 SDS-PAGE of j\^semm albumin purified with Blue Sepharose FF affinitychromatographyM:寬范圍蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)1:東方田鼠血清白蛋白Lane M: Broad range protein molecular weight marker (100 kD, 70 kD，50 kD，35 kD, 25 kD).14

不同濃度東方田鼠血清白蛋白與日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)共培養(yǎng)，在96 h內(nèi)連續(xù)觀察白蛋白培養(yǎng)的童蟲(chóng)，計(jì)算活童蟲(chóng)數(shù)，統(tǒng)計(jì)童蟲(chóng)死亡率（圖1-3、1-4)。觀察結(jié)果顯示，2.5 mg/ml的東方田鼠血清白蛋白的殺蟲(chóng)率為37.94%, 5 mg/ml的東方田鼠血清白蛋白的殺蟲(chóng)率為43.25%，10 mg/ml的東方田鼠血清白蛋白的殺蟲(chóng)率為殺蟲(chóng)率為48.3%,陽(yáng)性對(duì)照含20%的東方田鼠血清其殺蟲(chóng)率為33.92%，陰性對(duì)照10 mg/ml的昆明小鼠白蛋白其殺蟲(chóng)率為12.36%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯不：純化后的東方田鼠白蛋白和陽(yáng)性對(duì)照血清對(duì)童蟲(chóng)具有很強(qiáng)的殺傷作用，童蟲(chóng)死亡率明顯高于昆明小鼠血清白蛋白陰性對(duì)照處理組。童蟲(chóng)培養(yǎng)96 h后，顯微鏡下可見(jiàn)：活童蟲(chóng)結(jié)構(gòu)完整，能伸縮轜動(dòng)
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2857025