血吸蟲病是一種嚴(yán)重危害人民身心健康的人獸共患寄生蟲性傳染病,在我國仍然是一個重要的公共衛(wèi)生問題。流行病學(xué)調(diào)查和人工感染實驗研究結(jié)果表明：東方田鼠Microtus fortis)是日本血吸蟲的非適宜宿主,也是唯一一種對日本血吸蟲具有天然抗性、感染血吸蟲后不致病的哺乳動物。在前期實驗的基礎(chǔ)上,本研究通過藍色瓊脂糖凝膠親和層析,直接從東方田鼠血清中分離、純化獲得了一個對日本血吸蟲童蟲具有顯著殺傷作用的蛋白——白蛋白。為了進一步了解東方田鼠血清白蛋白抗日本血吸蟲的作用機理,我們用FITC標(biāo)記東方田鼠血清白蛋白,來追蹤其在日本血吸蟲童蟲體內(nèi)的作用部位,應(yīng)用日本血吸蟲腸道內(nèi)的組織蛋白酶Legumain來消化東方田鼠血清白蛋白,并構(gòu)建了東方田鼠血清白蛋白的真核表達載體,制備條件培養(yǎng)基,驗證了其表達產(chǎn)物對日本血吸蟲童蟲的殺傷效果。 ILKAP是本課題組從東方田鼠骨髓細胞cDNA文庫中篩選出來的一種抗性基因,本研究利用東方田鼠骨髓蛋白與日本血吸蟲童蟲蛋白通過免疫共沉淀實驗,聯(lián)合MALDI-TOF-MS分析,鑒定出與ILKAP作用的8種相關(guān)蛋白,接著將基因ILKAP和Tegument antigen (TA)分別克隆到真核表達載體pcDNA3.1/myc-His(-)b和pCMV-Tag2b,共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞后,通過免疫共沉淀和Western blotting驗證了ILKAP和Tegument antigen的相互作用,為進一步闡明其在抗日本血吸蟲的作用機制及發(fā)現(xiàn)新的抗性相關(guān)蛋白提供線索。 一、東方田鼠血清白蛋白的分離、純化、鑒定及對日本血吸蟲童蟲的殺傷效果 實驗通過藍色瓊脂糖凝膠層析柱分離得到東方田鼠血清白蛋白溶液,透析、冷凍干燥后,通過10%SDS-PAGE電泳進行分析。將純化的白蛋白與體外培養(yǎng)的日本血吸蟲童蟲共孵育,實驗結(jié)果顯示：東方田鼠白蛋白濃度為2.5mg/m1時,童蟲死亡率為37.94%(P0.05),隨著白蛋白濃度的增加,童蟲死亡率也增加,與對照組相比,具有統(tǒng)計學(xué)意義。 二、東方田鼠血清白蛋白條件培養(yǎng)基的制備及對日本血吸蟲童蟲的殺傷效果 本實驗將東方田鼠白蛋白基因重組到真核表達載體pcDNA3.1(+),制備東方田鼠白蛋白的條件培養(yǎng)基,檢測其真核表達產(chǎn)物體外殺傷日本血吸蟲童蟲效果。實驗結(jié)果顯示：東方田鼠albumin的條件培養(yǎng)基殺蟲率為38.7%(P0.05),與對照組相比具有顯著的殺蟲效果。 三、東方田鼠血清白蛋白在日本血吸蟲童蟲體內(nèi)的定位及Legumain對東方田鼠血清白蛋白的消化 將熒光素(FITC)標(biāo)記的東方田鼠血清白蛋白與日本血吸蟲童蟲共孵育,白蛋白終濃度為5mg/ml,于37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)童蟲。24h及48h后分別收獲童蟲,于OLYMPUS倒置熒光顯微鏡下觀察熒光出現(xiàn)的部位。結(jié)果發(fā)現(xiàn),FITC標(biāo)記的東方田鼠血清白蛋白與日本血吸蟲童蟲共孵育24h后,在童蟲腸道內(nèi)有熒光素聚集,孵育48h后,熒光素在童蟲腸道內(nèi)的聚集更加明顯。 為了進一步了解東方田鼠抗日本血吸蟲童蟲的作用機制,我們分析了日本血吸蟲腸道內(nèi)常見的幾種內(nèi)肽酶：組織蛋白酶B、組織蛋白酶D、組織蛋白酶L和組織蛋白酶AE。通過文獻資料查閱和序列分析發(fā)現(xiàn)：只有Legumain對東方田鼠和小白鼠白蛋白的氨基酸序列有切割位點的變化。因此我們利用Legumain分別消化東方田鼠和小白鼠血清白蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Legumain對東方田鼠和小白鼠血清白蛋白的消化存在顯著差異。 四、與ILKAP相互作用的日本血吸蟲童蟲蛋白的篩選 在早期抗日本血吸蟲研究中,課題組建立了東方田鼠骨髓細胞cDNA文庫,通過表達克隆法對該文庫進行抗性基因的篩選,從gE77次級亞基因池中篩選到抗性候選基因gE77.43,其編碼的產(chǎn)物為整合素連接激酶相關(guān)絲氨酸／蘇氨酸磷酸酶(ILKAP)。前期研究首次發(fā)現(xiàn)ILKAP具有顯著的殺傷日本血吸蟲童蟲的效果。因此,本研究利用東方田鼠骨髓蛋白與日本血吸蟲童蟲蛋白,通過免疫共沉淀實驗,聯(lián)合質(zhì)譜分析鑒定與8種與ILKAP相互作用的血吸蟲童蟲蛋白質(zhì)。 五、與ILKAP相互作用的日本血吸蟲童蟲蛋白的驗證 東方田鼠骨髓蛋白與日本血吸蟲童蟲蛋白通過免疫共沉淀實驗和質(zhì)譜分析共篩選了8個可能與ILKAP相互作用的血吸蟲童蟲蛋白質(zhì)。為進一步驗證篩選出來的蛋白質(zhì)是否與ILKAP存在相互作用,本實驗采用免疫共沉淀結(jié)合Western blotting發(fā)現(xiàn)童蟲蛋白TA確實與ILKAP存在直接相互作用。本研究利用脂質(zhì)體分別將Myc-TA-pcDNA3.1/(-)b和Flag-ILKAP-pCMV-2b轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞,建立ILKAP-Flag和TA-Myc高表達的HEK293T細胞；通過免疫共沉淀實驗證實了日本血吸蟲蛋白TA與東方田鼠骨髓ILKAP之間的相互作用,為進一步闡明東方田鼠抗日本血吸蟲的作用機制及發(fā)現(xiàn)新的靶作用位點提供線索。
【學(xué)位單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2014
【中圖分類】：R383.24
【部分圖文】：

1東方田鼠白蛋白的分離、純化及對日本血吸蟲的殺傷效果洗脫曲線如圖1-1。圖示結(jié)果顯示目的峰與前鋒分離徹底，呈拋物線，且無脫尾現(xiàn)象和其他雜峰，表明透析處理后的血清經(jīng)藍色瓊脂糖親和層析后，分離效果好，可用于后續(xù)實驗分析。SDS-PAGE分析處理后的白蛋白純度，如圖1-2,圖示結(jié)果顯示PAGE膠中只有單一的一條帶，進一步表明處理后的血清經(jīng)藍色瓊脂糖親和層析后純度較高，幾乎無其他蛋白質(zhì)干擾。r -* ..……”￡-： ..二 ? _ 地. ~ ~.J—,.： — ."niy.',-.' ‘ "".'.fjiii' --- 二二,i■二 ???——v-?- ..一，…士-I-.””"十■- 1‘ T III丨.11: '? ■■■—“-圓 I三 =: J _2 r "”二：. -二 …：二 ‘.卜:-‘V —"T. B?. z I 1 ■*- -. 一- ."3~ ~ 1 \ . . 3 \ “ -- \：二:l^ ： “ "一 “ - * “‘ \ -5?-,^ ._:J— _ = ^ ^圖1-1藍色球脂糖凝膠FF親和色譜分離東方田鼠血清白蛋白的洗股圖Fig. 1-1 Elution profile of A^Tserum albumin with Blue Sepharose FF affinity chromatographicfractionation1:球蛋白 2:白蛋白1: A^serum globulin, 2: A/f serum albuminm PMT,； -1”'-1 OQ 70 巧.：50——nil35——25七難圖1-2親和層析純化后白蛋白的SDS-PAGE圖Fig. 1-2 SDS-PAGE of j\^semm albumin purified with Blue Sepharose FF affinitychromatographyM:寬范圍蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)1:東方田鼠血清白蛋白Lane M: Broad range protein molecular weight marker (100 kD, 70 kD，50 kD

現(xiàn)象和其他雜峰，表明透析處理后的血清經(jīng)藍色瓊脂糖親和層析后，分離效果好，可用于后續(xù)實驗分析。SDS-PAGE分析處理后的白蛋白純度，如圖1-2,圖示結(jié)果顯示PAGE膠中只有單一的一條帶，進一步表明處理后的血清經(jīng)藍色瓊脂糖親和層析后純度較高，幾乎無其他蛋白質(zhì)干擾。r -* ..……”￡-： ..二 ? _ 地. ~ ~.J—,.： — ."niy.',-.' ‘ "".'.fjiii' --- 二二,i■二 ???——v-?- ..一，…士-I-.””"十■- 1‘ T III丨.11: '? ■■■—“-圓 I三 =: J _2 r "”二：. -二 …：二 ‘.卜:-‘V —"T. B?. z I 1 ■*- -. 一- ."3~ ~ 1 \ . . 3 \ “ -- \：二:l^ ： “ "一 “ - * “‘ \ -5?-,^ ._:J— _ = ^ ^圖1-1藍色球脂糖凝膠FF親和色譜分離東方田鼠血清白蛋白的洗股圖Fig. 1-1 Elution profile of A^Tserum albumin with Blue Sepharose FF affinity chromatographicfractionation1:球蛋白 2:白蛋白1: A^serum globulin, 2: A/f serum albuminm PMT,； -1”'-1 OQ 70 巧.：50——nil35——25七難圖1-2親和層析純化后白蛋白的SDS-PAGE圖Fig. 1-2 SDS-PAGE of j\^semm albumin purified with Blue Sepharose FF affinitychromatographyM:寬范圍蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)1:東方田鼠血清白蛋白Lane M: Broad range protein molecular weight marker (100 kD, 70 kD，50 kD，35 kD, 25 kD).14

不同濃度東方田鼠血清白蛋白與日本血吸蟲童蟲共培養(yǎng)，在96 h內(nèi)連續(xù)觀察白蛋白培養(yǎng)的童蟲，計算活童蟲數(shù)，統(tǒng)計童蟲死亡率（圖1-3、1-4)。觀察結(jié)果顯示，2.5 mg/ml的東方田鼠血清白蛋白的殺蟲率為37.94%, 5 mg/ml的東方田鼠血清白蛋白的殺蟲率為43.25%，10 mg/ml的東方田鼠血清白蛋白的殺蟲率為殺蟲率為48.3%,陽性對照含20%的東方田鼠血清其殺蟲率為33.92%，陰性對照10 mg/ml的昆明小鼠白蛋白其殺蟲率為12.36%，實驗結(jié)果顯不：純化后的東方田鼠白蛋白和陽性對照血清對童蟲具有很強的殺傷作用，童蟲死亡率明顯高于昆明小鼠血清白蛋白陰性對照處理組。童蟲培養(yǎng)96 h后，顯微鏡下可見：活童蟲結(jié)構(gòu)完整，能伸縮轜動
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

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本文編號：2857025