食管癌是世界上常見(jiàn)的惡性腫瘤,已經(jīng)成為全球死亡的主要原因之一,且發(fā)病有明顯的地域和組織學(xué)類(lèi)型上的差異。根據(jù)全國(guó)腫瘤登記中發(fā)布的數(shù)據(jù),我國(guó)食管癌發(fā)病率為惡性腫瘤發(fā)病率的第四位,己成為威脅人民健康的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。目前認(rèn)為食管癌是多因素作用、多基因參與、多階段發(fā)展的疾病,有多個(gè)癌基因和抑癌基因多途徑綜合作用的結(jié)果。因此,尋找更多有效的食管癌相關(guān)腫瘤標(biāo)志物及食管癌治療的潛在靶點(diǎn),對(duì)降低食管癌的發(fā)病率和死亡率有重要的現(xiàn)實(shí)意義。果蠅Zeste基因增強(qiáng)子人類(lèi)同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)是表觀遺傳調(diào)控因子Polycomb group(PcG)蛋白家族重要成員,其與SUZ12和EED共同組成PRC2蛋白復(fù)合物(核心催化亞基),具有高度保守的甲基轉(zhuǎn)移酶活性,通過(guò)調(diào)節(jié)核小體組蛋白第27位賴氨(H3K27)三甲基化作用誘導(dǎo)沉默具有分化能力的PRC2靶基因,從而參與表觀遺傳學(xué)和基因表達(dá)的調(diào)控。人黑色素瘤抗原-A(melanoma-associated antigen gene,MAGE)屬于癌睪抗原,它編碼的腫瘤排斥抗原在細(xì)胞內(nèi)加工后產(chǎn)生一種抗原肽,并與人類(lèi)白細(xì)胞抗原Ⅰ類(lèi)分子(human leucocyte antigene-I,HLA-I)發(fā)生結(jié)合形成復(fù)合物,被自體細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxicity T lymphocyte,CTL)所識(shí)別,誘導(dǎo)相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞被進(jìn)行特異性殺傷,以達(dá)到治療腫瘤的目的。因此,MAGE是一種CTL介導(dǎo)的腫瘤特異性免疫治療的理想靶分子。越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證明,一些表遺傳學(xué)機(jī)制如DNA甲基化和組蛋白甲基化、乙酰化,在調(diào)節(jié)MAGE-I基因表達(dá)上起到了重要作用。前期研究結(jié)果顯示,DNA甲基化及組蛋白共價(jià)修飾涉及各種腫瘤基因的沉默,促進(jìn)腫瘤發(fā)生或者人類(lèi)癌癥的進(jìn)展。其中最重要的機(jī)制是通過(guò)EZH2沉默多種癌癥相關(guān)基因,EZH2可以使靶基因啟動(dòng)子處組蛋白H3賴氨酸K27發(fā)生三甲基化。在本研究中,我們探討了EZH2促進(jìn)食管癌進(jìn)展的可能機(jī)制,以及對(duì)腫瘤抗原MAGE-A11的表觀調(diào)控機(jī)制。我們首先利用CCK-8增殖和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EZH2對(duì)食管癌增殖、克隆等生物學(xué)功能的影響;并應(yīng)用染色質(zhì)免疫共沉淀等實(shí)驗(yàn)方法對(duì)EZH2與MAGE-A11間的相互作用進(jìn)行了研究。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:第一部分EZH2基因?qū)θ耸彻馨┘?xì)胞增殖的影響目的:探討過(guò)表達(dá)或沉默EZH2基因?qū)κ彻馨┘?xì)胞增殖的影響。方法:選用人食管癌細(xì)胞株ECA109、TE1、KYSE30、KYSE170作為研究對(duì)象。1)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)、Western blotting法分別檢測(cè)食管癌細(xì)胞EZH2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。2)然后采用qPCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)和沉默EZH2基因后對(duì)4株食管癌細(xì)胞EZH2 mRNA的表達(dá)變化。3)CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)和沉默EZH2基因及EZH2抑制劑DZNep處理對(duì)食管癌細(xì)胞增殖能力和克隆形成率的影響。結(jié)果:1)食管癌ECA109、TE1細(xì)胞中EZH2 mRNA和蛋白水平明顯高于KYSE30、KYSE170細(xì)胞(P0.05)。2)食管癌TE1、ECA109細(xì)胞轉(zhuǎn)染EZH2-ShRNA后EZH2表達(dá)水平下調(diào)(均P0.05)、細(xì)胞增殖能力降低(1.07±0.08 vs 1.59±0.09,P0.05;0.88±0.08 vs 1.05±0.11,P0.05)、克隆形成數(shù)下調(diào)[(200.00±11.43)vs(480.00±13.10)個(gè),P0.05;(88.00±8.16)vs(220.00±14.69)個(gè),P0.05]。3)KYSE30、KYSE170細(xì)胞轉(zhuǎn)染EZH2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后EZH2表達(dá)水平升高(均P0.05)、細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)(1.06±0.07 vs 0.76±0.06,P0.05;3.36±0.30 vs 1.50±0.08,P0.05)、克隆形成數(shù)顯著升高[(45.00±3.27)vs(18.00±1.63]個(gè),P0.05;(65.00±4.08)vs(23.00±2.45)個(gè),P0.05]。4)DZNep處理后,ECA109和TE1細(xì)胞增殖能力降低(t=21.29,16.83,均P0.05)、克隆形成數(shù)下降[(200.00±6.53)vs(500.00±16.33)個(gè),t=24.12,P0.05;(80.00±10.88)vs(480.00±8.98)個(gè),t=34.22,P0.05]。小結(jié):敲低EZH2基因表達(dá)或應(yīng)用EZH2抑制劑DZNep使食管癌增殖能力和克隆形成率降低;過(guò)表達(dá)EZH2能有效促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖和克隆形成能力。第二部分食管癌細(xì)胞中EZH2對(duì)MAGE-A11的表達(dá)調(diào)控目的:探索食管癌細(xì)胞中EZH2對(duì)MAGE-A11表達(dá)的影響及其相互作用的內(nèi)在機(jī)制。方法:1)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)方法檢測(cè)各食管癌細(xì)胞系MAGE-A11表達(dá)情況,以及去甲基化劑DAC對(duì)MAGE-A11表達(dá)的影響。2)采用染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)方法分析組蛋白H3K27me3對(duì)MAGE-A11啟動(dòng)子在食管癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。3)采用q PCR和Western Blot方法檢測(cè)敲低EZH2對(duì)MAGE-A11表達(dá)的影響。4)DAC與DZNep聯(lián)合用藥對(duì)食管癌Eca109和TE13細(xì)胞中MAGE-A11 mRNA和蛋白水平的表達(dá)影響。結(jié)果:1)食管癌Eca109和KYSE30細(xì)胞顯示出MAGE-A11 mRNA相對(duì)低表達(dá)(P0.05);而TE13細(xì)胞顯示MAGE-A11 mRNA相對(duì)高表達(dá)(P0.05)。2)在MAGE-A11低表達(dá)的Eca109和KYSE30細(xì)胞中,去甲基化劑DAC對(duì)MAGE-A11誘導(dǎo)顯著(P0.05);而在MAGE-A11高表達(dá)的TE13細(xì)胞中,只顯示出DAC對(duì)MAGE-A11輕微的誘導(dǎo)。3)Eca109細(xì)胞中MAGE-A11啟動(dòng)子上的沉默標(biāo)記物占比較多,如H3K27me3,H3K9me3;而激活標(biāo)記物H3K4me3占比較少。相反,TE13細(xì)胞中MAGE-A11啟動(dòng)子上的沉默標(biāo)記物占比降低,如H3K27me3,H3K9me3;而激活標(biāo)記物H3K4me3占比增加。DAC處理Eca109細(xì)胞使得H3K27me3和H3K9me3與MAGE-A11啟動(dòng)子結(jié)合力降低,而H3K4me3與MAGE-A11啟動(dòng)子結(jié)合增強(qiáng)。4)在Eca109細(xì)胞中敲低EZH2或應(yīng)用DZNep處理后,H3K27me3在MAGE-A11啟動(dòng)子上的表達(dá)明顯下降。5)敲低EZH2表達(dá)后,Eca109細(xì)胞中MAGE-A11表達(dá)明顯增高。6)在MAGE-A11高甲基化的Eca109細(xì)胞中,DZNep與DAC聯(lián)合藥物使MAGE-A11 mRNA表達(dá)增高,且顯著高于單獨(dú)DZNep用藥;而在MAGE-A11低甲基化的TE13細(xì)胞中,DZNep與DAC聯(lián)合藥物或DZNep單獨(dú)用藥均對(duì)MAGE-A11 mRNA表達(dá)沒(méi)有顯著影響。小結(jié):1)食管癌Eca109和KYSE30細(xì)胞顯示出MAGE-A11高甲基化狀態(tài);TE13處于MAGE-A11低甲基化狀態(tài)。2)在高甲基化的Eca109細(xì)胞中,EZH2通過(guò)介導(dǎo)組蛋白H3K27me參與了MAGE-A11啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。結(jié)論:EZH2可促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖和克隆形成能力,并且在MAGE-A11基因高甲基化食管癌細(xì)胞中,EZH2介導(dǎo)的組蛋白H3K27me3甲基化參與了MAGE-A11啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。EZH2異常的過(guò)表達(dá)能夠充當(dāng)食管癌病人預(yù)測(cè)不良預(yù)后指標(biāo),并且阻斷EZH2的表達(dá),或許可以為ESCC治療提供新的策略。
【學(xué)位單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R735.1;R392.1
【部分圖文】：

各種食管癌細(xì)胞中EZH2mRNA和蛋白的表達(dá)Fig.1ExpressionofEZH2mRNAandproteininesophagealcancerTE1,

圖 2 EZH2 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及沉默質(zhì)粒在 4 株食管癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率，**P<0.01Fig.2 Transfection efficiency of EZH2 overexpression plasmid and silencingplasmid in four esophageal cancer cells,**P<0.01

研 究 論 文26CCK-8 檢測(cè)結(jié)果（圖3）顯示：轉(zhuǎn)染EZH2-ShRNA后，食管癌ECA109、TE1 細(xì)胞的增殖能力低于未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞（t =45.03，3.77；均 P<0.05）,表明敲低 EZH2 能抑制細(xì)胞的增殖能力；轉(zhuǎn)染 EZH2 后，KYSE30、KYSE170細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)（t =14.70, 42.30；均 P<0.05；圖 4），表明過(guò)表達(dá)EZH2 能促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖。4. DZNep 抑制食管癌 ECA109、TE1 細(xì)胞的增殖能力CCK-8 檢測(cè)結(jié)果（圖 5）顯示，DZNep 處理高表達(dá) EZH2 的食管癌ECA109、TE1 細(xì)胞 48 h 后,顯著抑制細(xì)胞的增殖(t =21.29, 16.83 , 均P<0.05),表明 DZNep 可抑制食管癌細(xì)胞的增殖能力。5. 過(guò)表達(dá)或沉默 EZH2 對(duì)食管癌細(xì)胞克隆形成率的影響克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染 EZH2-ShRNA 后，食管癌 TE1、ECA109細(xì)胞的克隆形成數(shù)目顯著降低[(200.00 ± 11.43) vs (480.00 ± 13.10) 個(gè)
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 孫芳;潘云;李艷;;組蛋白修飾在常見(jiàn)血液系統(tǒng)腫瘤中作用的研究進(jìn)展[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2015年04期

2 毛曉韻;姚凡;金鋒;;EZH2與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系[J];中華腫瘤防治雜志;2010年02期

本文編號(hào)：2854553