發(fā)布時間：2020-10-24 13:53

　　 食管癌是世界上常見的惡性腫瘤,已經(jīng)成為全球死亡的主要原因之一,且發(fā)病有明顯的地域和組織學類型上的差異。根據(jù)全國腫瘤登記中發(fā)布的數(shù)據(jù),我國食管癌發(fā)病率為惡性腫瘤發(fā)病率的第四位,己成為威脅人民健康的重大公共衛(wèi)生問題。目前認為食管癌是多因素作用、多基因參與、多階段發(fā)展的疾病,有多個癌基因和抑癌基因多途徑綜合作用的結果。因此,尋找更多有效的食管癌相關腫瘤標志物及食管癌治療的潛在靶點,對降低食管癌的發(fā)病率和死亡率有重要的現(xiàn)實意義。果蠅Zeste基因增強子人類同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)是表觀遺傳調控因子Polycomb group(PcG)蛋白家族重要成員,其與SUZ12和EED共同組成PRC2蛋白復合物(核心催化亞基),具有高度保守的甲基轉移酶活性,通過調節(jié)核小體組蛋白第27位賴氨(H3K27)三甲基化作用誘導沉默具有分化能力的PRC2靶基因,從而參與表觀遺傳學和基因表達的調控。人黑色素瘤抗原-A(melanoma-associated antigen gene,MAGE)屬于癌睪抗原,它編碼的腫瘤排斥抗原在細胞內加工后產(chǎn)生一種抗原肽,并與人類白細胞抗原Ⅰ類分子(human leucocyte antigene-I,HLA-I)發(fā)生結合形成復合物,被自體細胞毒性T細胞(cytotoxicity T lymphocyte,CTL)所識別,誘導相應的腫瘤細胞被進行特異性殺傷,以達到治療腫瘤的目的。因此,MAGE是一種CTL介導的腫瘤特異性免疫治療的理想靶分子。越來越多的實驗證明,一些表遺傳學機制如DNA甲基化和組蛋白甲基化、乙�；�,在調節(jié)MAGE-I基因表達上起到了重要作用。前期研究結果顯示,DNA甲基化及組蛋白共價修飾涉及各種腫瘤基因的沉默,促進腫瘤發(fā)生或者人類癌癥的進展。其中最重要的機制是通過EZH2沉默多種癌癥相關基因,EZH2可以使靶基因啟動子處組蛋白H3賴氨酸K27發(fā)生三甲基化。在本研究中,我們探討了EZH2促進食管癌進展的可能機制,以及對腫瘤抗原MAGE-A11的表觀調控機制。我們首先利用CCK-8增殖和克隆形成實驗檢測EZH2對食管癌增殖、克隆等生物學功能的影響;并應用染色質免疫共沉淀等實驗方法對EZH2與MAGE-A11間的相互作用進行了研究。主要研究內容和結果如下:第一部分EZH2基因對人食管癌細胞增殖的影響目的:探討過表達或沉默EZH2基因對食管癌細胞增殖的影響。方法:選用人食管癌細胞株ECA109、TE1、KYSE30、KYSE170作為研究對象。1)采用實時熒光定量PCR(qPCR)、Western blotting法分別檢測食管癌細胞EZH2 mRNA和蛋白的表達水平。2)然后采用qPCR檢測過表達和沉默EZH2基因后對4株食管癌細胞EZH2 mRNA的表達變化。3)CCK-8增殖實驗、克隆形成實驗檢測過表達和沉默EZH2基因及EZH2抑制劑DZNep處理對食管癌細胞增殖能力和克隆形成率的影響。結果:1)食管癌ECA109、TE1細胞中EZH2 mRNA和蛋白水平明顯高于KYSE30、KYSE170細胞(P0.05)。2)食管癌TE1、ECA109細胞轉染EZH2-ShRNA后EZH2表達水平下調(均P0.05)、細胞增殖能力降低(1.07±0.08 vs 1.59±0.09,P0.05;0.88±0.08 vs 1.05±0.11,P0.05)、克隆形成數(shù)下調[(200.00±11.43)vs(480.00±13.10)個,P0.05;(88.00±8.16)vs(220.00±14.69)個,P0.05]。3)KYSE30、KYSE170細胞轉染EZH2過表達質粒后EZH2表達水平升高(均P0.05)、細胞增殖能力顯著增強(1.06±0.07 vs 0.76±0.06,P0.05;3.36±0.30 vs 1.50±0.08,P0.05)、克隆形成數(shù)顯著升高[(45.00±3.27)vs(18.00±1.63]個,P0.05;(65.00±4.08)vs(23.00±2.45)個,P0.05]。4)DZNep處理后,ECA109和TE1細胞增殖能力降低(t=21.29,16.83,均P0.05)、克隆形成數(shù)下降[(200.00±6.53)vs(500.00±16.33)個,t=24.12,P0.05;(80.00±10.88)vs(480.00±8.98)個,t=34.22,P0.05]。小結:敲低EZH2基因表達或應用EZH2抑制劑DZNep使食管癌增殖能力和克隆形成率降低;過表達EZH2能有效促進食管癌細胞的增殖和克隆形成能力。第二部分食管癌細胞中EZH2對MAGE-A11的表達調控目的:探索食管癌細胞中EZH2對MAGE-A11表達的影響及其相互作用的內在機制。方法:1)采用實時熒光定量PCR(qPCR)方法檢測各食管癌細胞系MAGE-A11表達情況,以及去甲基化劑DAC對MAGE-A11表達的影響。2)采用染色質免疫共沉淀實驗方法分析組蛋白H3K27me3對MAGE-A11啟動子在食管癌細胞中轉錄調控作用。3)采用q PCR和Western Blot方法檢測敲低EZH2對MAGE-A11表達的影響。4)DAC與DZNep聯(lián)合用藥對食管癌Eca109和TE13細胞中MAGE-A11 mRNA和蛋白水平的表達影響。結果:1)食管癌Eca109和KYSE30細胞顯示出MAGE-A11 mRNA相對低表達(P0.05);而TE13細胞顯示MAGE-A11 mRNA相對高表達(P0.05)。2)在MAGE-A11低表達的Eca109和KYSE30細胞中,去甲基化劑DAC對MAGE-A11誘導顯著(P0.05);而在MAGE-A11高表達的TE13細胞中,只顯示出DAC對MAGE-A11輕微的誘導。3)Eca109細胞中MAGE-A11啟動子上的沉默標記物占比較多,如H3K27me3,H3K9me3;而激活標記物H3K4me3占比較少。相反,TE13細胞中MAGE-A11啟動子上的沉默標記物占比降低,如H3K27me3,H3K9me3;而激活標記物H3K4me3占比增加。DAC處理Eca109細胞使得H3K27me3和H3K9me3與MAGE-A11啟動子結合力降低,而H3K4me3與MAGE-A11啟動子結合增強。4)在Eca109細胞中敲低EZH2或應用DZNep處理后,H3K27me3在MAGE-A11啟動子上的表達明顯下降。5)敲低EZH2表達后,Eca109細胞中MAGE-A11表達明顯增高。6)在MAGE-A11高甲基化的Eca109細胞中,DZNep與DAC聯(lián)合藥物使MAGE-A11 mRNA表達增高,且顯著高于單獨DZNep用藥;而在MAGE-A11低甲基化的TE13細胞中,DZNep與DAC聯(lián)合藥物或DZNep單獨用藥均對MAGE-A11 mRNA表達沒有顯著影響。小結:1)食管癌Eca109和KYSE30細胞顯示出MAGE-A11高甲基化狀態(tài);TE13處于MAGE-A11低甲基化狀態(tài)。2)在高甲基化的Eca109細胞中,EZH2通過介導組蛋白H3K27me參與了MAGE-A11啟動子的轉錄調節(jié)。結論:EZH2可促進食管癌細胞的增殖和克隆形成能力,并且在MAGE-A11基因高甲基化食管癌細胞中,EZH2介導的組蛋白H3K27me3甲基化參與了MAGE-A11啟動子的轉錄調節(jié)。EZH2異常的過表達能夠充當食管癌病人預測不良預后指標,并且阻斷EZH2的表達,或許可以為ESCC治療提供新的策略。
【學位單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R735.1;R392.1
【部分圖文】：

各種食管癌細胞中EZH2mRNA和蛋白的表達Fig.1ExpressionofEZH2mRNAandproteininesophagealcancerTE1,

圖 2 EZH2 過表達質粒及沉默質粒在 4 株食管癌細胞中的轉染效率，**P<0.01Fig.2 Transfection efficiency of EZH2 overexpression plasmid and silencingplasmid in four esophageal cancer cells,**P<0.01

研 究 論 文26CCK-8 檢測結果（圖3）顯示：轉染EZH2-ShRNA后，食管癌ECA109、TE1 細胞的增殖能力低于未轉染組細胞（t =45.03，3.77；均 P<0.05）,表明敲低 EZH2 能抑制細胞的增殖能力；轉染 EZH2 后，KYSE30、KYSE170細胞的增殖能力增強（t =14.70, 42.30；均 P<0.05；圖 4），表明過表達EZH2 能促進食管癌細胞的增殖。4. DZNep 抑制食管癌 ECA109、TE1 細胞的增殖能力CCK-8 檢測結果（圖 5）顯示，DZNep 處理高表達 EZH2 的食管癌ECA109、TE1 細胞 48 h 后,顯著抑制細胞的增殖(t =21.29, 16.83 , 均P<0.05),表明 DZNep 可抑制食管癌細胞的增殖能力。5. 過表達或沉默 EZH2 對食管癌細胞克隆形成率的影響克隆形成實驗結果顯示，轉染 EZH2-ShRNA 后，食管癌 TE1、ECA109細胞的克隆形成數(shù)目顯著降低[(200.00 ± 11.43) vs (480.00 ± 13.10) 個
【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 孫芳;潘云;李艷;;組蛋白修飾在常見血液系統(tǒng)腫瘤中作用的研究進展[J];中國實驗血液學雜志;2015年04期

2 毛曉韻;姚凡;金鋒;;EZH2與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關系[J];中華腫瘤防治雜志;2010年02期

本文編號：2854553