目的:為探討沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvB導(dǎo)致巨噬細胞遲發(fā)性焦亡的機制,本研究第一部分通過建立沙門菌感染的小鼠巨噬細胞RAW264.7模型,探討spvB在感染過程中對炎性小體NLRP3和NLRC4的影響。第二部分利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建的nlrp3基因敲除RAW264.7細胞,研究NLRP3對巨噬細胞焦亡的影響,探討spvBB導(dǎo)致細胞遲發(fā)性焦亡的機制,為預(yù)防和控制沙門菌感染提供新思路和方法。方法:一、沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvB對炎性小體NLRP3和NLRC4的影響本部分研究利用攜帶spvB基因的鼠傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)毒株SL1344、spvB基因敲除株SL1344-△spvB及spvB基因回補株SL1344-c-△spvB分別與RAW264.7共培養(yǎng),感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)10:1,建立巨噬細胞感染模型,分別在感染后不同時間點收集細胞進行實驗。1.透射電鏡觀察巨噬細胞超微結(jié)構(gòu)變化制備超薄切片,透射電子顯微鏡下觀察不同感染組RAW264.7細胞超微結(jié)構(gòu)變化。2.qPCR測定nlrp3和nlrc4的轉(zhuǎn)錄水平提取細胞總RNA,qPCR檢測不同感染組細胞的nlrp3和nlrc4的轉(zhuǎn)錄水平。3.Western blot檢測炎性小體及焦亡相關(guān)蛋白的表達水平提取細胞總蛋白,Western blot 檢測 NLRP3、NLRC4、GSDMD、GSDMD-NT和Caspase-1的表達水平。4.活性氧檢測試劑盒分析細胞內(nèi)活性氧ROS的含量收集細胞后,按試劑盒說明書進行探針裝載,細胞內(nèi)的ROS可以氧化DCFH生成有熒光的DCF,依據(jù)DCF的熒光強度分析其水平。二、NLRP3對巨噬細胞焦亡的影響以 SL1344、SL1344-△spvB 和 SL1344-c-△spvB 作為受試菌,按感染復(fù)數(shù) 10:1分別感染野生型和nlrp3-/-R△W264.7細胞,建立感染模型,分別在不同時間點收集細胞進行實驗。1.qPCR測定細胞中nlrc4的轉(zhuǎn)錄水平收集各感染組細胞,提取細胞總RNA,qPCR檢測不同感染組中nlrc4的轉(zhuǎn)錄水平。2.Western blot 檢測 GSDMD 和 GSDMD-NT 的表達水平提取細胞總蛋白,Western blot檢測不同感染組GSDMD和GSDMD-NT的表達水平。3.比色法測定Caspase-1的活性Caspase-1活性檢測試劑盒檢測不同感染組Caspase-1的活性。4.ELISA法檢測IL-lβ的含量收集細胞上清,IL-1β酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒分析不同感染組細胞培養(yǎng)液上清中細胞因子IL-1β分泌量。結(jié)果:一、沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvB對炎性小體NLRP3和NLRC4的影響1.巨噬細胞的超微結(jié)構(gòu)變化透射電鏡下發(fā)現(xiàn),SL1344和SL1344-c-△spvB感染組細胞感染后18 h可見大量伸出細胞和脫落的囊泡狀結(jié)構(gòu),多數(shù)囊泡狀內(nèi)富含細菌,感染后24 h易見細胞膜破裂和細胞溶解;SL1344-△spvB感染組胞內(nèi)細菌數(shù)量少于SL1344和SL1344-c-△spvB感染組細胞的細菌數(shù),感染后18h和24h可見線粒體腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張等病變,但發(fā)生膜破裂和溶解的細胞明顯減少。2.nlrp3和nlrc4的轉(zhuǎn)錄水平qPCR結(jié)果顯示,各組細胞nlrp3的轉(zhuǎn)錄水平隨感染時間的延長逐漸降低,在感染早期(1-4 h),SL1344和SL1344-c-△spvB感染組nlrp3的水平均低于SL1344-△spvB感染組,感染后1h差異最為明顯;各組細胞nlrc4的轉(zhuǎn)錄水平隨感染時間的延長逐漸升高,在感染后期(18-24h),SL1344和SL1344-c-△spvB感染組nlrc4的水平均明顯低于SL1344-△spvB感染組,感染后24 h差異最為明顯。3.炎性小體及焦亡相關(guān)蛋白的表達水平Westetn blot結(jié)果顯示,在細胞感染早期(1-4h),SL1344和SL1344-c-△spvB感染組NLRP3的表達量均低于SL1344-△spvB感染組,在感染后4 h差異最為明顯;在細胞感染的后期,SL1344和SL1344-c-△spvB感染組NLRC4的表達量均低于SL1344-△spvB感染組,在感染后24 h 差異最為明顯。感染后4 h至12 h,SL1344和SL1344-c-△spvB感染組GSDMD-NT蛋白水平均明顯低于SL1344-△spvB感染組,感染后18 h SL1344感染組GSDMD-NT顯著升高�；罨虲aspase-1 p20的蛋白水平在各感染組的變化趨勢與GSDMD-NT相同。4.細胞內(nèi)ROS的含量多功能酶標(biāo)儀、熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測結(jié)果均表明,在感染后2h SL1344和SL1344-c-△sp△B感染組ROS含量均低于SL1344-△spvB感染組。二、NLRP3對巨噬細胞焦亡的影響1.野生型和nlrp3-/-RAW264.7細胞nlrc4的轉(zhuǎn)錄水平qPCR結(jié)果顯示nlrc4在細胞感染后18 h和24 h明顯升高,野生型和nlrp3-/-RAW264.7細胞被SL1344和SL1344-c-△spvB感染后nlrc4的轉(zhuǎn)錄水平均低于SL1344-△spvB感染組;各感染組nlrp3-/-RAW264.7細胞nlrc4轉(zhuǎn)錄水平均明顯低于野生型RAW264.7感染細胞。2.GSDMD和GSDMD-NT的表達水平Westste blot結(jié)果發(fā)現(xiàn),在感染后8 h、18 h和24 h,各組nlrp3-/-RAW264.7細胞GSDMD-NT蛋白水平均顯著低于野生型RAW264.7細胞感染組;在感染18 h和24 h后,SL1344和SL1344-c-AspvB感染組GSDMD-NT的表達量均低于SL1344-△spvB 感染組。3.Caspase-1活性和IL-1β的檢測比色法測定Caspase-1的活性、ELISA法檢測感染細胞上清IL-1β的結(jié)果顯示,野生型RAW264.7細胞隨感染時間延長,各感染組Caspase-1的活性和細胞上清中IL-1β的含量逐漸上升,SL1344和SL1344-c-△spvB感染組與SL1344-△spvB感染組在感染18 h,24 h組間差異明顯;nlrp3-/-RAW264.7感染組Caspase-1活性和IL-1β含量隨感染時間緩慢上升,且在同一時間點各組之間未見明顯差異。結(jié)論:1.沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvB導(dǎo)致的巨噬細胞遲發(fā)性焦亡與其影響炎性小體NLRP3和NLRC4的活化密切相關(guān),在感染早期spvB宿主菌抑制細胞ROS產(chǎn)生和NLRP3活化,進而抑制炎性小體NLRC4活化,導(dǎo)致遲發(fā)性焦亡。2.巨噬細胞炎性小體NLRP3是沙門菌spvB基因抑制炎性小體NLRC4活化的重要因素,深入研究spvB基因?qū)ρ仔孕◇wNLRP3和感染結(jié)局的影響,可為揭示細菌致病的新機制提供依據(jù)。
【學(xué)位單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R378
【部分圖文】：

過程中發(fā)揮著重要作用。細胞焦亡（pyroptosis）是 2001 年發(fā)現(xiàn)并證實的一種新的程序性細胞死亡方往認(rèn)為其特征為依賴于天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspaecific proteinase 1, Caspase-1)，并伴有大量促炎癥因子的釋放[14]，后來發(fā)spase-4/5/11 作為細菌內(nèi)毒素（LPS）的胞內(nèi)受體，在被 LPS 活化后也可誘導(dǎo)，是 LPS 導(dǎo)致膿毒癥的關(guān)鍵機制[15]。邵峰課題組報道致病菌刺激細胞內(nèi)模式受體（PRR）激活炎性小體形成，依賴于 Caspase-1 的經(jīng)典焦亡途徑和依賴spase-4/5/11 的非經(jīng)典焦亡途徑啟動誘發(fā)細胞焦亡，發(fā)現(xiàn) Caspase-4/5/11 下游sdermin 家族蛋白在細胞焦亡中發(fā)揮了關(guān)鍵作用�，F(xiàn)已知，Caspase-1/4/5/11 通割由 500 多個氨基酸組成的 Gasdermin 家族蛋白之一 GSDMD，使后者 N、的結(jié)構(gòu)域分開，進而釋放 N 端的片段（GSDMD-NT）。GSDMD-NT 可以識別合細胞膜上的磷脂類分子，并進一步在細胞膜形成孔道，導(dǎo)致細胞內(nèi)外滲透化，最終使得細胞膜裂解，發(fā)生焦亡。

附圖 2. 經(jīng)典和非經(jīng)典性炎性小體在細胞焦亡中的作用（Cell Research. 2015, 25: 1183-1184）文獻報道沙門菌質(zhì)粒毒力基因 spvB 可引發(fā)細胞遲發(fā)性焦亡（18-24 h）[22]，但相應(yīng)機制尚不明確。spvB 編碼效應(yīng)蛋白 SpvB 具有 ADP 核糖基轉(zhuǎn)移酶活性[23]，我們既往研究發(fā)現(xiàn) spvB 可通過解聚細胞骨架在感染過程中抑制宿主細胞自噬[11]。炎性小體與細胞自噬的關(guān)系在感染與炎癥研究領(lǐng)域已引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。文獻報道 spvB 的 ADP 核糖基轉(zhuǎn)移酶活性可降低 DNA 的修復(fù)能力從而降低活性氧含量，而活性氧含量影響炎性小體的組裝[24]。炎性小體被激活后，可誘導(dǎo)炎性小體復(fù)合物的組裝，使 Caspase-1 前體切割后形成有活性的 Caspase-1，Caspase-1 進一步將 pro-IL-1β切割，釋放有活性的 IL-1β[25]。最新研究進展表明 GSDMD-NT 在細胞膜形成孔洞，其只能在細胞內(nèi)膜打孔，不能在細胞外膜打孔，因此不會損傷臨近的細胞，但是 GSDMD-NT 可以破壞細菌膜使其裂解，從而控制感染[26]。自噬與炎性小體活化是機體免疫應(yīng)答的兩種重要

沙門菌質(zhì)粒毒力基因 spvB 導(dǎo)致巨噬細胞遲發(fā)性焦亡的機制研究 第一部分2.2 沙門菌毒力基因 spvB 在感染早期抑制 nlrp3 的轉(zhuǎn)錄qPCR 檢測 nlrp3 的 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，各組細胞 nlrp3 的轉(zhuǎn)錄水平隨感染時間的延長逐漸降低，nlrp3 在細胞感染的早期(1-4 h)，SL1344 和SL1344-c-ΔspvB 感染后 nlrp3 的水平均低于 SL1344-ΔspvB 感染組，感染后 1 h 和 2h 差異最為明顯；在細胞感染的后期（18-24 h）發(fā)現(xiàn) SL1344、SL1344-ΔspvB 和SL1344-c-ΔspvB 后 nlrp3 的表達量無明顯差異。
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本文編號：2854766