目的:本研究采用骨髓來(lái)源的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial Progenitor Cells,EPCs)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)作為研究細(xì)胞,擬通過(guò)兩種細(xì)胞非接觸式共培養(yǎng),驗(yàn)證BMSC具有促進(jìn)EPCs體外增殖和成管的作用,并研究EPCs的VEGFA、b-FGF等細(xì)胞因子及TRPC通道的表達(dá)情況,進(jìn)一步闡明兩種細(xì)胞共培養(yǎng)下BMSC促進(jìn)EPCs的增殖、分化的作用以及相關(guān)因子的表達(dá),為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供理論依據(jù)。方法:1.犬骨髓來(lái)源的EPCs和BMSC分離培養(yǎng)及鑒定實(shí)驗(yàn):取健康雜種幼犬,1~2月齡,麻醉后于雙側(cè)脛骨行骨髓穿刺,抽取脛骨骨髓3ml。使用犬淋巴分離液密度梯度離心法配合條件誘導(dǎo)培養(yǎng)基分離培養(yǎng)犬骨髓EPCs;采用差速貼壁法分離培養(yǎng)犬BMSC;通過(guò)倒置相差顯微鏡觀(guān)察并記錄兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài),體外EPCs誘導(dǎo)成管、BMSC誘導(dǎo)成骨實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物鑒定細(xì)胞。2.共培養(yǎng)體系下EPCs增殖和成管實(shí)驗(yàn):設(shè)立兩實(shí)驗(yàn)組和一組對(duì)照組,共培養(yǎng)組收集BMSC及EPCs第2代細(xì)胞,使用Transwell非接觸共培養(yǎng),誘導(dǎo)組使用誘導(dǎo)培養(yǎng)基,對(duì)照組使用對(duì)照培養(yǎng)基。通過(guò)使用CCK-8檢測(cè)三組EPCs增殖情況并繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn),通過(guò)基質(zhì)膠成管實(shí)驗(yàn)對(duì)比三組間EPCs成管能力,驗(yàn)證BMSC具有促進(jìn)EPCs增殖、分化的生物學(xué)功能。3.共培養(yǎng)體系下EPCs細(xì)胞因子及TRPC通道的表達(dá):設(shè)立共培養(yǎng)組、誘導(dǎo)組及對(duì)照組,并進(jìn)行三個(gè)組的VEGFA、b-FGF、CD133、CD34、TRPC1、TRPC4免疫組化染色,測(cè)量各組平均光密度值進(jìn)行對(duì)比。收集1d、3d、5d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組EPCs提取總RNA使用qRT-PCR檢測(cè)上述目標(biāo)基因的表達(dá)水平并進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果:1.犬EPCs和BMSC體外分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)及其鑒定:密度梯度離心法分離EPCs的細(xì)胞數(shù)量較少,純度高,原代培養(yǎng)5d后EPCs鏡下可見(jiàn)集落樣生長(zhǎng)細(xì)胞,細(xì)胞形態(tài)呈多角形或長(zhǎng)條狀。傳代后延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間,細(xì)胞呈典型的“鋪路石”或“鵝卵石”樣;成管誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)12h后可見(jiàn)EPCs成條索狀排列形成管樣結(jié)構(gòu);流式細(xì)胞儀檢測(cè)第2代細(xì)胞,結(jié)果顯示CD133與CD34呈陽(yáng)性。通過(guò)差速貼壁法收集到的BMSC原代細(xì)胞較多。原代培養(yǎng)4h后BMSC開(kāi)始貼壁,5d后鏡下可見(jiàn)貼壁細(xì)胞增大,細(xì)胞形態(tài)呈條索或角形。成骨誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)21d后可見(jiàn)鈣結(jié)節(jié),茜素紅染色呈陽(yáng)性;流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示CD29陽(yáng)性,HAL-DR陰性。2.使用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況并繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn),在BMSC與EPC共培養(yǎng)條件下EPCs生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期較其余兩組提前,4d時(shí)共培養(yǎng)組對(duì)比其余兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),4h后共培養(yǎng)組對(duì)比對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),8h后共培養(yǎng)組對(duì)比其余兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.共培養(yǎng)組VEGFA、b-FGF、TRPC1免疫組化結(jié)果呈陽(yáng)性,對(duì)比其余兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),共培養(yǎng)組TRPC4對(duì)比對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。qRT-PCR檢測(cè)培養(yǎng)1d后EPCs各組間的目標(biāo)基因間差異不明顯,培養(yǎng)3d后各目標(biāo)基因間開(kāi)始出現(xiàn)差異,培養(yǎng)5d后共培養(yǎng)條件下EPCs的VEGFA、b-FGF、TRPC1、TRPC4表達(dá)均高于其余兩組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),共培養(yǎng)組CD133相對(duì)其余兩組有低表達(dá)的趨勢(shì)。結(jié)論:1.BMSC在體外環(huán)境下可以促進(jìn)EPCs的增殖能力及成管能力。2.EPCs在體外BMSC的促進(jìn)下高表達(dá)VEGFA、b-FGF、TRPC1、TRPC4,通過(guò)這些目標(biāo)基因的表達(dá)可以促進(jìn)EPCs的生物學(xué)功能。共培養(yǎng)體系能夠促進(jìn)EPCs的成熟分化,CD133的下調(diào)趨勢(shì)可能與此有關(guān)。
【學(xué)位單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R329.2
【部分圖文】：

.2 犬內(nèi)皮祖細(xì)胞成管腔實(shí)驗(yàn)成管誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn) 12 小時(shí)后，EPCs 可見(jiàn)部分細(xì)胞排列成條索狀，形成結(jié)構(gòu)（圖 2-A）。誘導(dǎo) 24 小時(shí)后可見(jiàn)管樣結(jié)構(gòu)增多（圖 2-B）。圖 1 倒置顯微鏡下 EPCs 細(xì)胞形態(tài)。（A）EPCs 原代細(xì)胞接種后（200x）。（B）EPCs 原代培養(yǎng) 5后（200x）。（C）EPCs 集落式生長(zhǎng)融合（100x）。（D）EPCs 傳代后延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間（100x）。Figure 1 Morphology of EPCs under an inverted microscope.(A) EPCs Primary cells after inoculatio(200x). (B) After 5 d EPCs primary culture (200x). (C) EPCs colony growth fusion (100x). (D)Elongation of culture time after passage of EPCs (100x).

.3 內(nèi)皮祖細(xì)胞流式細(xì)胞儀鑒定用流式細(xì)胞儀對(duì)第2代EPCs的表面標(biāo)記物進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示CD13D34 表面標(biāo)記物陽(yáng)性（圖 3）。AB圖 2 倒置顯微鏡下 EPCs 成管實(shí)驗(yàn)。（A）EPCs 成管誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn) 12 小時(shí)后（200x）。（B）EPCs 成管誘導(dǎo) 24 小時(shí)后（200x）。Figure 2 EPCs into tube experiments under an inverted microscope.(A) After 12 hours of EPCs tubeinduction experiment (200x). (B) EPCs tube induction 24 h later (200x).

.3 內(nèi)皮祖細(xì)胞流式細(xì)胞儀鑒定用流式細(xì)胞儀對(duì)第2代EPCs的表面標(biāo)記物進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示CD1D34 表面標(biāo)記物陽(yáng)性（圖 3）。AB圖 2 倒置顯微鏡下 EPCs 成管實(shí)驗(yàn)。（A）EPCs 成管誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn) 12 小時(shí)后（200x）。（B）EPCs 成誘導(dǎo) 24 小時(shí)后（200x）。Figure 2 EPCs into tube experiments under an inverted microscope.(A) After 12 hours of EPCs tubeinduction experiment (200x). (B) EPCs tube induction 24 h later (200x).
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Hadar Zigdon-Giladi;Utai Rudich;Gal Michaeli Geller;Ayelet Evron;;Recent advances in bone regeneration using adult stem cells[J];World Journal of Stem Cells;2015年03期

2 譚科芳;孫璇;;內(nèi)皮祖細(xì)胞移植治療的研究進(jìn)展和臨床應(yīng)用前景[J];中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2014年11期

本文編號(hào)：2854512