Angiocidin是從肺癌細(xì)胞中分離到的一種蛋白質(zhì)，它可以誘導(dǎo)人單核白血病細(xì)胞THP-1分化為巨噬細(xì)胞，前期有研究指出MAPK、NF-κB與PI3K通路介導(dǎo)了這一效應(yīng)。S5a是細(xì)胞26S蛋白酶體的亞單位，它在氨基酸序列上與Angiocidin高度一致，本科室前期研究表明，S5a亦可以促進(jìn)THP-1分化為巨噬細(xì)胞。S5a通過結(jié)合細(xì)胞膜死亡受體6（DR6）進(jìn)而激活NF-κB信號通路，最終促進(jìn)THP-1向巨噬細(xì)胞分化。盡管如此，S5a誘導(dǎo)THP-1分化的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制尚不清楚，究竟是哪些基因在這個過程中扮演關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因（hub gene）的角色值得探究，又是何種分子將NF-κB通路激活這一信號進(jìn)一步向下游傳導(dǎo)，直至開啟細(xì)胞分化之門仍舊未知。本文從下述兩個方面，闡述S5a誘導(dǎo)THP-1分化的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制。第一部分S5a誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因研究 為了探討哪些基因是S5a誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化過程中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因（hubgene），我們首先用重組的MBP-S5a誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞12h，同時MBP處理的THP-1細(xì)胞作為對照組。隨后，我們采用Affymetrix芯片去檢測12h的實(shí)驗(yàn)組與對照組全基因表達(dá)情況，一共發(fā)現(xiàn)了994個差異表達(dá)的基因。我們利用這些差異表達(dá)基因進(jìn)行了信號通路分析（pathway analysis），并發(fā)現(xiàn)總共存在20個有顯著性差異的信號通路。這些通路富集了174個差異表達(dá)的基因。我們用這174個差異基因構(gòu)建了基因與基因相互作用網(wǎng)絡(luò)，并剔除了與其他基因幾乎無相互作用的基因，最終得到包含102個差異基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)，我們認(rèn)為該網(wǎng)絡(luò)反映了S5a誘導(dǎo)THP-1分化的機(jī)制。通過對該網(wǎng)絡(luò)中的所有基因按度值進(jìn)行排序，我們最后確認(rèn)了10個THP-1分化相關(guān)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因，它們的度值排名網(wǎng)絡(luò)前10位。第二部分S5a激活NF-κB通路并進(jìn)一步啟動THP-1細(xì)胞分化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究 我們發(fā)現(xiàn)，在MBP-S5a誘導(dǎo)THP-1后，細(xì)胞中P65蛋白的磷酸化水平明顯升高，這說明S5a激活了NF-κB信號通路。同樣，我們使用商品化生物素標(biāo)記的S5a誘導(dǎo)THP-1之后，NF-κB信號通路亦被激活。本科室前期研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用NF-κB通路抑制劑預(yù)處理THP-1細(xì)胞后，再用S5a誘導(dǎo)，THP-1細(xì)胞增強(qiáng)的吞噬能力被顯著削弱。我們還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NF-κB通路被抑制后，S5a抑制THP-1生長及促進(jìn)THP-1高表達(dá)炎癥介質(zhì)這兩種效應(yīng)同樣被顯著削弱。綜上，我們推斷S5a激活NF-κB信號通路并進(jìn)一步介導(dǎo)THP-1分化。我們在mRNA和蛋白質(zhì)水平均證明了S5a誘導(dǎo)THP-1之后轉(zhuǎn)錄因子wt1表達(dá)明顯上調(diào)，當(dāng)NF-κB通路被抑制后，這種上調(diào)也明顯被抑制。當(dāng)采用wt1干擾RNA成功地阻斷S5a誘導(dǎo)的wt1表達(dá)上調(diào)后，S5a誘導(dǎo)的THP-1生長抑制及吞噬能力增強(qiáng)這兩種效應(yīng)被顯著削弱。這說明S5a通過激活NF-κB通路上調(diào)wt1表達(dá)，從而介導(dǎo)THP-1分化。我們還發(fā)現(xiàn)，在S5a誘導(dǎo)THP-1分化的過程中，轉(zhuǎn)錄因子c-myb的表達(dá)在mRNA及蛋白質(zhì)水平均顯著下調(diào)。前期研究認(rèn)為c-myb的高表達(dá)阻礙了單核細(xì)胞的分化，而它的下調(diào)是多種細(xì)胞分化的必需條件，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論預(yù)期一致。NF-κB抑制劑預(yù)處理細(xì)胞后，即使有S5a誘導(dǎo)，c-myb也不再明顯下調(diào)。之后，我們使用wt1干擾RNA成功阻斷S5a誘導(dǎo)的wt1上調(diào)后，c-myb表達(dá)的下調(diào)也明顯受到抑制，而染色體免疫共沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)表明了S5a處理THP-1細(xì)胞后，wt1轉(zhuǎn)錄因子確實(shí)結(jié)合在c-myb基因啟動子區(qū)域“cgcccccgc”序列上，既往研究表明wt1可結(jié)合在此序列上抑制c-myb的轉(zhuǎn)錄，結(jié)合我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和前期研究，我們認(rèn)為S5a激活NF-κB通路后，wt1表達(dá)上調(diào)并進(jìn)一步抑制了c-myb基因的轉(zhuǎn)錄，從而為細(xì)胞分化克服了障礙，啟動了THP-1分化。 此研究在本課題組前期研究的基礎(chǔ)上，更全面深入地揭示了S5a誘導(dǎo)THP-1分化的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制，找到了若干可能發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因，闡明了S5a誘導(dǎo)NF-κB信號通路激活后又是如何進(jìn)一步轉(zhuǎn)導(dǎo)信號并最終啟動THP-1細(xì)胞分化的機(jī)制。本研究將為單核細(xì)胞白血病的誘導(dǎo)分化治療以及炎癥性疾病的抗炎治療提供新的藥物設(shè)計(jì)靶點(diǎn)參考，并且將我們對單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化機(jī)制的認(rèn)識進(jìn)一步地加深。
【學(xué)位單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2014
【中圖分類】：R3411
【部分圖文】：

-S5a處理THP-1細(xì)胞48小時，平行地設(shè)立胞吞噬實(shí)驗(yàn)來檢測THP-1細(xì)胞的吞噬能了明顯增強(qiáng)，S5a組吞噬細(xì)胞的百分比較兩個組，處理24小時后行實(shí)時熒光定量重要炎癥介質(zhì)的表達(dá)水平，結(jié)果證明在顯著升高（圖2），這個結(jié)果從高表達(dá)炎功誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞。隨，單純MBP標(biāo)簽來做對照，于48小時的影響，結(jié)果表明S5a處理組較對照組相（圖3），一般說來，幼稚的原始細(xì)胞往細(xì)胞其增殖能力則相對弱很多，從細(xì)胞了THP-1細(xì)胞的分化。綜上所述，本實(shí)化為巨噬細(xì)胞。MBP-S5a MBP

- 26 -圖 7 S5a 誘導(dǎo) THP-1 細(xì)胞分化過程中基因相互作用網(wǎng)絡(luò)我們利用上述差異表達(dá)基因構(gòu)建了基因與基因相互作用網(wǎng)絡(luò)，并剔除了與其他基因均無相互作用的基因，最終得到了包含 102 個基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。圖中紅色的基因?yàn)樯险{(diào)基因，藍(lán)色的基因?yàn)橄抡{(diào)基因，箭頭表示二者之間的相互作用，由調(diào)控基因指向靶基因。相互作用的具體形式包括磷酸化、激活表達(dá)等等。

純 MBP 對照組持續(xù)并且顯著升高。這同時說明了 S5a 處理 THP-1 細(xì)胞后激活了 NF-κB 信號通路。圖9 生物素標(biāo)記的S5a誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞后P65蛋白的磷酸化水平較陰性對照組持續(xù)顯著升高我們使用商品化的生物素標(biāo)記 S5a 處理 THP-1 細(xì)胞，并于處理后 1 小時、6 小時和 12 小時抽提蛋白質(zhì)行 western-blot 實(shí)驗(yàn)，檢測總 P65 蛋白的水平和磷酸化 P65 蛋白的水平，結(jié)果表明兩組中總 P65 蛋白水平幾乎無差異，但 S5a 誘導(dǎo) THP-1 細(xì)胞后 P65 蛋白的磷酸化水平較陰性對照組持續(xù)并顯著升高。這同時說明了 S5a 處理 THP-1 細(xì)胞后激活了 NF-κB 信號通路。（二）NF-κB 信號通路的激活介導(dǎo)了 S5a 誘導(dǎo) THP-1 細(xì)胞分化過程中的生長抑制現(xiàn)象
【參考文獻(xiàn)】

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1 楊璐;曹悅鞍;彭朝勝;夏菁;張文洛;田力;;Wt1反義寡核苷酸阻斷白血病微小殘留病wt1基因表達(dá)的體外研究[J];中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2011年01期

2 孟月生,MD Minden;WT1基因轉(zhuǎn)染抑制白血病細(xì)胞生長和集落形成并促進(jìn)細(xì)胞分化[J];中華血液學(xué)雜志;2003年05期

3 盧青,劉革修,歐大明,曾高峰;WT-1通過下調(diào)c-myb表達(dá)抑制U937細(xì)胞增殖[J];中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志;2000年05期

本文編號：2852901