發(fā)布時間：2020-10-23 10:14

　　 結(jié)核病是世界上嚴(yán)重威脅人類健康的傳染病。世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,2016年新增結(jié)核病患者約1040萬,并且有170萬人因結(jié)核病而死亡�？ń槊�(BCG)是目前世界范圍內(nèi)唯一使用的抗結(jié)核疫苗。雖然BCG控制兒童結(jié)核病十分有效,但對成人結(jié)核病的預(yù)防效果在不同地區(qū)表現(xiàn)出極大差異(0~80%)。隨著耐藥和耐多藥結(jié)核病的出現(xiàn)和流行率的增加,迫切需要開發(fā)更加理想的新型結(jié)核疫苗。引起結(jié)核病的主要病原菌結(jié)核分枝桿菌是胞內(nèi)寄生菌,細(xì)胞免疫應(yīng)答對機(jī)體抵抗此類胞內(nèi)寄生菌的感染至關(guān)重要。開發(fā)出能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)的抗結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞免疫應(yīng)答是目前該領(lǐng)域研究的一個主要方向。目前處于臨床試驗(yàn)階段的新型結(jié)核疫苗主要有減毒活疫苗、蛋白亞單位疫苗及病毒載體疫苗等三類。這些疫苗的選擇的抗原主要是動物研究或人體試驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)的可以產(chǎn)生較強(qiáng)免疫應(yīng)答的分泌性蛋白,如TB10.4,ESAT6,MPT64,Ag85B和Ag85A等。上述疫苗嘗試?yán)貌《净駼CG表達(dá)抗原,或利用含有特定佐劑的重組蛋白作為免疫原誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗結(jié)核桿菌的細(xì)胞免疫應(yīng)答。雖然抗結(jié)核疫苗研發(fā)取得了一些成果,但至今仍沒有新的抗結(jié)核病疫苗產(chǎn)品上市。因此,本論文擬通過構(gòu)建表達(dá)Ag85B-TB10.4融合蛋白的痘病毒(MVAH4)和腺病毒(Ad H4)疫苗、高表達(dá)Ag85B-TB10.4的痘病毒(MVATH4)疫苗和Ag85B/TB10.4-BLP蛋白亞單位疫苗,研究同源和異源病毒載體Prime-boost免疫方案、不同抗原表達(dá)能力的病毒載體、及BLP用作佐劑對抗結(jié)核疫苗的動物免疫效果,為新型抗結(jié)核疫苗的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。病毒載體疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。痘病毒(MVA)和腺病毒(Ad)載體是目前疫苗研發(fā)領(lǐng)域常用的兩種病毒載體,在抗結(jié)核疫苗研發(fā)過程中具有重要的潛力。目前處于臨床試驗(yàn)階段的重組病毒載體抗結(jié)核疫苗中,多數(shù)采用單一重組病毒進(jìn)行多次免疫的方案。而近些年的研究發(fā)現(xiàn),采用不同病毒載體的prime-boost免疫方案,可以有效避免機(jī)體的抗載體免疫應(yīng)答,從而提升疫苗的效果。因此,本研究構(gòu)建了能表達(dá)Ag85B-TB10.4融合蛋白的MVAH4和Ad H4兩種重組病毒載體結(jié)核疫苗,并研究了同源和異源prime-boost免疫方案產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的區(qū)別。Ad H4和MVAH4均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)答。含有Ad H4(Ad H4-Ad H4、Ad H4-MVAH4和MVAH4-Ad H4)的免疫方案誘導(dǎo)產(chǎn)生更高水平的抗原特異性抗體,產(chǎn)生更高水平的IFN-γ,以及更高比例的活化的CD8+T細(xì)胞(CD69+CD8+T細(xì)胞)。并且不同的免疫方案都誘導(dǎo)產(chǎn)生比較均衡的Th1和Th2免疫應(yīng)答。Ad H4-MVAH4免疫組的脾細(xì)胞在Ag85B蛋白的MHC-I表位肽的刺激下,產(chǎn)生分泌IFN-γ的脾細(xì)胞數(shù)量明顯多于其他免疫組。此外,Ad H4-MVAH4免疫組分泌Th1相關(guān)細(xì)胞因子(IFN-γ和TNF-α)的水平也明顯高于其他組。這些結(jié)果說明,包含Ad H4的免疫方案與只含有BCG或MVAH4的免疫方案相比,可以更有效的誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。此外,Ad H4-MVAH4的免疫方案可能會產(chǎn)生更理想的保護(hù)效果。Ad H4-Ad H4或MVAH4-MVAH4同源prime-boost免疫結(jié)果顯示,在免疫劑量相同的情況下,MVAH4誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答明顯弱于Ad H4。為了解決這一問題,本研究嘗試在抗原蛋白N端基因加上了t PA信號肽序列,構(gòu)建得到了MVATH4重組病毒結(jié)核疫苗。經(jīng)過Western Blot驗(yàn)證,相對于MVAH4,MVATH4感染細(xì)胞后,表達(dá)的抗原蛋白顯著上升。將MVATH4免疫小鼠后,檢測免疫應(yīng)答發(fā)現(xiàn),相比于MVAH4組,MVATH4免疫誘導(dǎo)的抗體水平,細(xì)胞因子分泌水平以及活化T細(xì)胞的比例均有顯著升高,同時沒有改變Th1和Th2的應(yīng)答傾向。除了免疫原和免疫方案外,佐劑也是影響疫苗效果的關(guān)鍵因素。目前幾種處于臨床試驗(yàn)階段的蛋白亞單位結(jié)核疫苗采取的方案是將抗原蛋白與激活TLR4或TLR9途徑的佐劑進(jìn)行混合,免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答。然而有研究表明,結(jié)核分枝桿菌在感染細(xì)胞后,會表達(dá)一系列TLR2的配體成分。這些TLR2激活劑在誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗結(jié)核的免疫應(yīng)答方面發(fā)揮了重要作用。細(xì)菌樣顆粒(BLP)是由食品行業(yè)常用的乳酸乳球菌經(jīng)酸處理制備的肽聚糖殼,臨床實(shí)驗(yàn)證明BLP是具有良好的安全性。以往的研究中證實(shí),用乳酸乳球菌制備的BLP是TLR2激活劑,它不與TLR3、4、5、7、8和9相互作用。本研究使用BLP顆粒作為佐劑,將Ag85B和TB10.4蛋白通過PA與BLP連接,通過肌肉注射途徑免疫小鼠。對免疫小鼠后的免疫應(yīng)答進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn),雖然蛋白+BLP免疫組誘導(dǎo)的特異性抗體水平及細(xì)胞因子的分泌水平均高于蛋白免疫組,但誘導(dǎo)的仍主要是體液免疫應(yīng)答,并且其誘導(dǎo)的Th1/Th2/Th17的應(yīng)答模式與BCG免疫組并不相同。綜上所述,本研究首先構(gòu)建了表達(dá)Ag85B-TB10.4融合蛋白的MVAH4和Ad H4病毒載體疫苗,并評價了兩種疫苗在不同免疫方案下誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。接著,構(gòu)建了加入t PA信號肽序列的MVATH4,并驗(yàn)證了疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的增強(qiáng)。此外,我們使用BLP作為蛋白疫苗佐劑,但免疫小鼠后并未有效的誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。本研究主要從免疫原性方面對不同的疫苗進(jìn)行了探討,更深入的應(yīng)答機(jī)制以及疫苗保護(hù)力需要更進(jìn)一步的研究。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

1.1.1 結(jié)核病結(jié)核病已經(jīng)存在了數(shù)千年，至今仍是全球健康面臨的一個主要問題。結(jié)核病每年可造成數(shù)百萬人的健康問題。盡管經(jīng)過及時的診斷和正確的治療，結(jié)核病可以被治愈，其仍是世界十大死亡原因之一，導(dǎo)致的死亡數(shù)目排在艾滋病之上。據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)[1]，2016 年因結(jié)核病死亡的人數(shù)為 170 萬，其中 40萬因結(jié)核病死亡的人是艾滋病患者。經(jīng)過評估，2016 年大約有 1040 萬的結(jié)核病新增病例，其中五百九十萬是男性，三百五十萬是女性，還有一百萬是兒童�？傮w而言，90%的病例為成年人，10%的病例為兒童，男女比例為 1.6：1。大部分的新發(fā)病例在亞洲（61%）和非洲（26%）地區(qū)，少部分在中東（7%），歐洲（3%）和美國（3%）。30 個高負(fù)擔(dān)國家覆蓋了 87%的新發(fā)病例，其中印度，中國，印度尼西亞三個國家就覆蓋了全球 45%的新發(fā)病例。而不同國家的發(fā)病率也差異很大，具體分布如圖 1.1 所示。

幾種與其密切相關(guān)的菌也會引起疾病,其中包括非洲分枝桿菌anum）和牛分枝桿菌（M. bovis）。雖然在分枝桿菌屬中有數(shù)以百計(jì)的其但大多數(shù)是環(huán)境腐生物種，它們要么是非致病菌（例如恥垢分枝桿菌matis）），要么是機(jī)會致病菌（例如鳥分枝桿菌（M. avium）和龜分枝桿nae））。結(jié)核分枝桿菌、非洲分枝桿菌和牛分枝桿菌是能夠具有正常免個體中引起疾病的病原菌。其致病性的原理目前仍是研究的熱點(diǎn)，并且楚結(jié)核分枝桿菌具有獨(dú)特的毒力因子, 能夠躲過宿主免疫進(jìn)而引起疾1883 年，Robert Koch 通過發(fā)現(xiàn)結(jié)核組織中的“抗酸”桿菌（能夠在酸性后仍保持顏色），首次鑒定出結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核病的致病菌。此后不生物就在簡單的肉湯培養(yǎng)基中得到培養(yǎng)生長。結(jié)核分枝桿菌的一個不尋是它的生長速度很慢（約 24 小時復(fù)制一代）。因此, 通常需要花費(fèi)數(shù)個證明其生長。結(jié)核分枝桿菌和相關(guān)分枝桿菌生長緩慢的原理目前仍不

吉林大學(xué)博士學(xué)位論文肉芽腫形成部位會有新的毛細(xì)血管產(chǎn)生，推測新生血管提供額外的氧氣和營養(yǎng)來源，有利于分枝桿菌復(fù)制[7]。在小鼠模型中，在肉芽腫位置，M.tb 最先感染樹突狀細(xì)胞，然后在誘導(dǎo)產(chǎn)生適應(yīng)性免疫應(yīng)答之前招募巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞。在 C57BL/6 小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，在肉芽腫部位缺乏氧氣，而在人體中，肉芽腫通常被表征為缺氧和營養(yǎng)缺乏的干酪樣壞死性中心[8]。
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1 寇一鳴;結(jié)核分枝桿菌新型疫苗的構(gòu)建及免疫學(xué)評價[D];吉林大學(xué);2018年

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3 孔紅梅;新型結(jié)核疫苗p846的保護(hù)作用及其機(jī)制探討[D];蘇州大學(xué);2013年

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6 陸云芝;重組卡介苗rBCG::Ag85B-ESAT6-Rv2608與rBCG::Ag85B-ESAT6-Rv3620c的免疫原性研究[D];復(fù)旦大學(xué);2010年

7 王崢;結(jié)核分枝桿菌特異性抗原基因的克隆及納米疫苗的初步研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

8 黃家禹;樹突狀細(xì)胞在結(jié)核病免疫中的作用及機(jī)制[D];福建醫(yī)科大學(xué);2010年

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本文編號：2852899