目的:研究Notch信號(hào)通路在骨形成蛋白9(Bone Morphogenetic Protein 9,BMP9)誘導(dǎo)小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)C3H10T1/2成骨分化過(guò)程中的作用及機(jī)制。方法:1.NICD過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2,實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)質(zhì)粒NICD在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá),Western Blot(WB)檢測(cè)NICD的蛋白表達(dá)水平。2.NICD及BMP9共同處理C3H10T1/2,通過(guò)檢測(cè)堿磷酶(ALP)活性、染色及茜素紅S染色明確NICD對(duì)BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過(guò)程的作用,RT-qPCR檢測(cè)成骨分化過(guò)程中相關(guān)基因Runx2、OPN、OCN、JunB、Smad1、Id1、OSX 的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá),WB 檢測(cè) Runx2、OPN、OCN、JunB、Smad1/5/8、p-Smad1/5/8蛋白的表達(dá)水平。3 JunB基因的激動(dòng)劑12-0-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯(TPA)和Notch通路的抑制劑γ-分泌酶抑制劑(DAPT)分別與BMP9或NICD共同處理C3H10T1/2,ALP染色、活性及茜素紅S染色檢測(cè)成骨分化情況,WB再次檢測(cè)上述成骨分化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。4.另外,集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞自我更新能力及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化,WB檢測(cè)NICD對(duì)增殖相關(guān)蛋白PCNA、Cyclin D1表達(dá)水平的影響。5.BMP9、NICD或TPA處理后的細(xì)胞注入裸鼠背側(cè)皮下異位成骨;MicroCT檢測(cè)異位成骨參數(shù)骨體積(BV/TV)、骨小梁厚度(BV/TV)、骨小梁間距(Tb/Sp)、骨小梁數(shù)量(Tb/Sp)、骨密度(BMD)的差異情況,免疫組化檢測(cè)成骨蛋白R(shí)unx2、OPN、OCN、JunB及成脂分化相關(guān)蛋白CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(C/EBPα)、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)在異位骨中的表達(dá)情況,蘇木精-伊紅染色、三色染色、阿新藍(lán)染色檢測(cè)異位骨中骨組織、軟骨組織的生成情況,油紅O染色檢測(cè)異位骨中脂肪組織形成情況。結(jié)果:1.RT-qPCR及WB結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)NICD質(zhì)粒在C3H10T1/2細(xì)胞中高表達(dá);2.NICD可抑制BMP9誘導(dǎo)的C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化過(guò)程中成骨相關(guān)基因Runx2、OPN、OCN、OSX、JunB的表達(dá)及ALP形成和鈣鹽沉積,同時(shí)抑制成脂分化相關(guān)蛋白C/EBPα及PPARγ的表達(dá),但不影響Smad1/5/8、p-Smad1/5/8的表達(dá);3.基因JunB的激動(dòng)劑TPA可逆轉(zhuǎn)NICD抑制BMP9誘導(dǎo)成骨分化的作用,促進(jìn)成骨分化基因Runx2、OPN、OCN、JunB的表達(dá);4.Notch通路抑制劑DAPT促進(jìn)成骨分化相關(guān)基因p-Smad1/5/8、Runx2、OPN、OCN、JunB的表達(dá),但抑制早期成骨指標(biāo)ALP形成,促進(jìn)晚期成骨指標(biāo)鈣鹽沉積;6.集落成集實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞檢測(cè)顯示NICD明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖,NICD促進(jìn)增殖相關(guān)蛋白PCNA、CyclinD1的表達(dá);7.異位成骨實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NICD明顯抑制BMP9誘導(dǎo)的骨形成,免疫組化結(jié)果顯示NICD抑制異位骨中成骨分化基因Runx2、OPN、OCN、JunB的表達(dá),特殊染色HE、三色、阿新藍(lán)、油紅O染色顯示NICD抑制異位骨中骨組織、軟骨組織、脂肪組織的形成;8.TPA能逆轉(zhuǎn)NICD對(duì)BMP9誘導(dǎo)成骨的抑制作用,促進(jìn)成骨相關(guān)基因的表達(dá)及骨組織的形成。結(jié)論:NICD激活的Notch通路參與調(diào)控BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2成骨及成脂分化,通過(guò)下調(diào)基因JunB表達(dá)抑制BMP9誘導(dǎo)的成骨分化過(guò)程,但不影響B(tài)MP/Smad信號(hào),且具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

表達(dá)質(zhì)粒激活Ｎｏｔｃｈ通路。ＮＩＣＤ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細(xì)胞，４８ｈ后檢測(cè)ＮＩＣＤ表??達(dá)。ＲＴ－ｑＰＣＲ結(jié)果顯示，ＮＩＣＤ轉(zhuǎn)錄水平及Ｎｏｔｃｈ靶基因Ｈｅｙｌ、Ｈｅｓｌ較對(duì)照組明??顯增加（圖１Ａ）；?ＷＢ結(jié)果同樣顯示，與對(duì)照組相比，ＮＩＣＤ、ＢＭＰ９的蛋白表達(dá)水??平明顯上升（圖１Ｂ）。??Ａ?Ｂ??６〇－｜?□?ＢＭＰ９＋Ｃｏｎｔｒｏｌ??ｃ?■?ＢＭＰ９＋ＮＩＣＤ?ＢＭＰ９??？２??｜４０－?Ｉ?ＮＩＣＤ?＿??｜?２〇－?Ｉ?§?ｐ－ａｃｔｉｎ?—???＂Ｊ－ｌ?ｎｉ?－ｉ?－ｆ?，?／?／?，??＃?ｚ＃?，ｘ°?ｙ??圖１．?ＮＩＣＤ、ＢＭＰ９在Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細(xì)胞中高表達(dá)??Ｆｉｇ?ｌ．Ｔｈｅ?ｈｉｇｈ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ＮＩＣＤ?ａｎｄ?ＢＭＰ９?ｉｎ?Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２?ｃｅＵｓ??（Ａ）?Ｔｈｅ?ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ?ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＮＩＣＤ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｗａｓ?ｄｅｔｅｃｔｅｄ?ｂｙ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ＮＩＣＤ?ｏｒ?ｔｈｅ??Ｎｏｔｃｈ?ｔａｒｇｅｔ?ｇｅｎｅ?Ｈｅｙｌ，?Ｈｅｓｌ，?Ｈｅｓ５?ｖｉａ?ＲＴ－ｑＰＣＲ．．（Ｂ）?Ｔｈｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ＮＩＣＤ?ｗａｓ?ｄｅｔｅｃｔｅｄ?ｂｙ??ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ．??２．２?ＮＩＣＤ抑制ＢＭＰ９誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化??為明確Ｎｏｔｃｈ信號(hào)通路在ＢＭＰ９誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中的作用，??分別在ＮＣＥＤ或ＢＭＰ９處理細(xì)胞５ｄ、７ｄ后檢測(cè)早期成骨指標(biāo)ＡＬＰ表達(dá)，結(jié)果顯??示

Ｂｌａｎｋ?ＮＩＣＤ?Ｃｏｎｔｒｏｌ??圖５．?ＮＩＣＤ促進(jìn)細(xì)跑增殖且維持間充質(zhì)干細(xì)胞自我更新能力??Ｆｉｇ?５．?ＮＩＣＤ?ｉｓ?ｉｎｖｏｌｖｅｄ?ｉｎ?ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ?ｃｅｌｌｓ?ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ?ａｎｄ?ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ?ｂｏｎｅ?ｍａｒｒｏｗ??ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ?ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ??（Ａ）?Ｔｈｅ?ｃｅｌｌ?ｃｙｃｌｅ－ｒｅｌａｔｅｄ?ｇｅｎｅｓ?ＰＣＮＡ?ａｎｄ?ＣｙｃｌｉｎＤｌ?ｗｅｒｅ?ｄｅｔｅｃｔｅｄ?ｂｙ?ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｉｎ?ｃｅｌｌｓ??

圖７．ＮＩＣＤ抑制ＢＭＰ９誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化??Ｆｉｇ，７?ＮＩＣＤ?ｉｎｈｉｂｉｔｓ?ＢＭＰ９－ｉｎｄｕｃｅｄ?ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＭＳＣｓ??（Ａ）?Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?Ｃ／ＥＢＰａ?ａｎｄ?ＰＰＡＲｙ?ｗａｓ?ｄｅｔｅｃｔｅｄ?ｂｙ?ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔｔｉｎｇ?ａｆｔｅｒ?ｃｅｌｌｓ?ｗｅｒｅ?ｔｒｅａｔｅｄ??ｗｉｔｈ?Ａｄ－ＢＭＰ９，?ｔｈｅ?ＮＩＣＤ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｆｏｒ?９?ｄａｙｓ．?（Ｂ）?Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ?ｓｔａｉｎｉｎｇ?ｏｆ?ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ?ｓａｍｐｌｅｓ．?Ｆｒｏｚｅｎ??
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