目的為了探討巴德特-別德爾綜合征(BBS)蛋白在纖毛信號傳導(dǎo)中的作用,本文研究了萊茵衣藻BBS4蛋白的原核表達(dá)、純化及多克隆抗體制備。方法利用萊茵衣藻bbs4基因的cDNA序列構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28a(+)-bbs4和pMAL-c2X-bbs4,轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)后,誘導(dǎo)表達(dá)得到帶有麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)和6×His標(biāo)簽的融合蛋白,用純化后的帶有6×His標(biāo)簽的融合蛋白免疫新西蘭白兔,經(jīng)耳源靜脈采血,分離得到抗血清,間接ELISA法測得抗血清的效價,Western印跡法和免疫熒光實驗對所制備抗體的特異性進(jìn)行檢測。結(jié)果成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-bbs4和pMAL-c2X-bbs4。6×His-BBS4和MBP-BBS4融合蛋白的相對分子質(zhì)量分別為4.5×104和8.5×104,經(jīng)純化后得到純度85%、濃度0.5 mg/ml的目的蛋白用于免疫,測定效價為51 200,經(jīng)Western印跡法對C. reinhardtii CC-125檢測有較高的特異性,實現(xiàn)了萊茵衣藻BBS4蛋白的原核表達(dá)和多克隆抗體的制備。結(jié)論成功制備了萊茵衣藻BBS4的多克隆抗體,為BBS4在纖毛病中作用的深入研究奠定了基礎(chǔ)。
【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 菌株與質(zhì)粒
    1.2 實驗動物
    1.3 試劑
    1.4 pET-28a(+)-bbs4和p MAL-c2X-bbs4原核表達(dá)載體的構(gòu)建
    1.5 融合蛋白的表達(dá)
    1.6 融合蛋白的純化
        1.6.1 6×His-BBS4融合蛋白的純化
        1.6.2 麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP)-BBS4融合蛋白的純化
    1.7 多克隆抗體的制備
    1.8 ELISA測定的多克隆抗體效價
    1.9 BBS4抗體的純化
    1.1 0 Western印跡法檢測BBS4抗體
    1.1 1 免疫熒光實驗
2 結(jié)果
    2.1 成功構(gòu)建pET-28a(+)-bbs4和pMAL-c2X-bbs4原核表達(dá)載體
    2.2 融合蛋白成功表達(dá)
    2.3 獲得純化的6×His-BBS4融合蛋白
    2.4 獲得純化的MBP-BBS4融合蛋白
    2.5 抗血清效價的檢測結(jié)果
    2.6 抗體的特異性分析結(jié)果
    2.7 免疫熒光實驗結(jié)果
3 討論

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