瘧疾是一種由媒介按蚊傳播的傳染性寄生蟲病,全球廣泛流行。我國的瘧疾流行以間日瘧為主,雖然我國已成功啟動了消除瘧疾行動計劃,但本世紀前十年中部地區(qū)曾經(jīng)出現(xiàn)間日瘧疫情回升,表明瘧疾防治工作仍需加強。間日瘧原蟲感染者血液中的原蟲密度通常較低,由于漏診病例有可能成為當?shù)貍鞑サ臐撛趥魅驹?因此,及時有效地發(fā)現(xiàn)病例,無論是在瘧疾控制階段,還是瘧疾消除進程中,都具有十分重要的意義。 顯微鏡血涂片檢查是經(jīng)典的瘧疾實驗診斷方法,不但需要器材,操作費時費力,檢測結果很大程度上依賴于鏡檢人員的經(jīng)驗和責任心,在瘧疾低流行區(qū)漏檢率高,已不能滿足當前瘧疾消除的高要求。近年來,基于免疫層析的瘧疾快速診斷技術(Rapid Diagnostic Tests, RDTs)發(fā)展較快,因其特異性和敏感性均較高,無需儀器設備,操作簡單,結果易判讀,實施較為方便,非常適合瘧疾現(xiàn)場應用,其有效性在以惡性瘧流行為主的國家和地區(qū)已經(jīng)得到證實,WHO也給予了高度重視,更改了RDT用于瘧疾診斷的指針,強調(diào)只要條件允許,所有疑似病例均應在治療之前,進行實驗室瘧疾病原檢測。然而,迄今為止,仍無適合間日瘧診斷的RDT可用,主要原因在于缺少敏感度高,特異性強的間日瘧原蟲靶抗原,由于我國以間日瘧流行為主,因此,迫切需要研究開發(fā)適合現(xiàn)場應用的間日瘧快速診斷技術。 間日瘧原蟲(Plasmodium vivax, P. vivax)的體外培養(yǎng)技術尚不成熟,難以提供大量實驗材料,從感染者采集的血樣,其瘧原蟲密度低,且含有難以去除的宿主白細胞,因此,高純度的間日瘧原蟲樣本材料來源困難,已成為探尋間日瘧原蟲特異性抗原的重要瓶頸之一。通過基因重組表達制備的蛋白純度高,抗原性和天然蛋白類似,可成為解決缺少間日瘧原蟲特異性診斷抗原的新途徑之一。醛縮酶(Aldolase, ALD)是瘧原蟲糖酵解過程中的一種關鍵酶,以其作為檢測靶點的RDT,在惡性瘧檢測中也顯示出了較好的效果。間日瘧原蟲醛縮酶(PvALD)的基因序列已知,體外表達PvALD用于制備單抗,是解決缺乏間日瘧特異性快速診斷工具的一條可行的途徑。泛種特異性抗瘧原蟲單抗M26-32,能識別包括間日瘧原蟲在內(nèi)的五種瘧原蟲,對其抗體屬性的改造,可使之適于標記和檢測,利用已有間日瘧原蟲cDNA文庫和M26-32單抗的研究基礎,可篩選其潛在的間日瘧原蟲靶抗原基因。間日瘧原蟲基因組的正式發(fā)布,也為篩選新的間日瘧原蟲特異性抗原提供了新思路,蛋白序列中出現(xiàn)高度重復,是惡性瘧原蟲的重要特征,最早被廣泛應用的RDT靶抗原惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白2(PfHRP-2)存在著明顯串聯(lián)重復序列。根據(jù)基因組信息,對間日瘧原蟲全部蛋白序列數(shù)據(jù)進行挖掘和篩選,是開發(fā)潛在新型間日瘧原蟲特異性抗原的新手段之一。 本研究根據(jù)我國間日瘧流行特點,結合瘧疾防治新時期對新型快速診斷技術的實際需求,圍繞缺少高敏感性間日瘧原蟲特異性抗原這一科學問題展開研究。通過采用新的生物信息學手段,挖掘間日瘧原蟲基因組數(shù)據(jù)中全部蛋白序列中的重復序列信息,聯(lián)合使用多參數(shù)線性B細胞表位預測方法,篩選間日瘧原蟲特異性抗原肽。借鑒惡性瘧原蟲診斷性抗原研究的成功經(jīng)驗,選擇與乳酸脫氫酶(pLDH)屬性相似的間日瘧原蟲醛縮酶作為靶標,克隆其基因并表達重組蛋白,用于制備具有間日瘧診斷價值的PvALD單抗。在已有泛種特異性單抗M26-32和間日瘧原蟲cDNA文庫的研究基礎上,改造其抗體的屬性,使之適于標記和檢測,并篩選其潛在的間日瘧原蟲靶抗原基因。結合新材料技術,研制用于處理瘧原蟲感染血樣的新型瘧原蟲濾器,使之適合純化間日瘧原蟲感染紅細胞,為快速簡便地獲取蟲體進行抗原研究提供技術支持。 第一部分基于蛋白重復序列及線性B細胞表位預測篩選間日瘧原蟲特異性抗原肽 【目的】建立一種從間日瘧原蟲基因組數(shù)據(jù)庫中挖掘蛋白重復序列的方法,運用線性B細胞表位預測工具分析潛在的間日瘧原蟲特異性抗原肽,并使用實驗動物驗證。 【方法】從PlasmoDB網(wǎng)站下載V6.0版FASTA格式間日瘧原蟲蛋白序列文件,去除冗余數(shù)據(jù),格式化導入SQL數(shù)據(jù)庫。用Delphi語言編寫重復序列查找軟件,以一定長度的短肽序列為單位,逐一檢索其在全部蛋白序列中的重復次數(shù),并輸入到SQL數(shù)據(jù)表中。經(jīng)過運算,統(tǒng)計出重復序列較高的1,000個短肽,提交到BcePred網(wǎng)站,聯(lián)合使用4項參數(shù)進行連續(xù)B表位預測,再經(jīng)相似性比較,優(yōu)選其中具有間日瘧原蟲特異性的肽進行合成,偶聯(lián)KLH,免疫BALB/c小鼠。分別使用肽-ELISA法檢測免疫鼠血清和自然感染間日瘧患者血清中抗合成肽抗體滴度。 【結果】PlasmoDB V6.0版間日瘧原蟲全部蛋白序列為5,432個,經(jīng)導入SQL數(shù)據(jù)庫,由自編軟件分析其中16肽的重復次數(shù),共獲得了約300萬行數(shù)據(jù),經(jīng)統(tǒng)計篩選出重復序列較高的1,000個序列,逐一由BcePred網(wǎng)站四項參數(shù)聯(lián)合預測線性B細胞表位,以4項參數(shù)中3項達到或超過閾值為篩選條件,獲得22個候選肽,經(jīng)聚類分析和相似性比較,優(yōu)選了6個具有潛在間日瘧原蟲特異性表位的肽,人工合成并偶聯(lián)KLH后,免疫BALB/c小鼠。經(jīng)四次全程免疫后,肽-ELISA分別檢測小鼠血清,6個合成肽的滴度均超過1:9,000。20例間日瘧血清檢測結果的陽性率從5%~40%不等。 【結論】建立了從間日瘧原蟲基因組數(shù)據(jù)庫中挖掘蛋白重復序列的新方法,所獲肽序列經(jīng)線性B細胞表位預測,得到6個間日瘧特異性肽,經(jīng)動物實驗證實均能誘導產(chǎn)生高滴度抗體。 第二部分間日瘧原蟲醛縮酶的克隆、表達及單克隆抗體制備 【目的】克隆間日瘧原蟲醛縮酶編碼序列,分別用原核和真核兩種體系表達重組間日瘧原蟲醛縮酶,并制備單克隆抗體。 【方法】根據(jù)間日瘧原蟲模式株Salvador I的醛縮酶編碼區(qū)設計帶酶切位點的引物,以現(xiàn)場采集間日瘧患者血樣中DNA為模板,PCR擴增,分別將產(chǎn)物插入到pET32c和pPIC9K載體上,轉化大腸桿菌DH5α,獲得相應的重組質(zhì)粒。原核重組質(zhì)粒轉入表達菌BL21(DE3),誘導表達并經(jīng)His標簽純化重組蛋白。真核重組質(zhì)粒線性化后,轉入畢赤酵母GS115,誘導表達后純化重組蛋白。將原核、真核表達的兩種重組PvALD作為抗原,交替使用,并采用腹腔和皮下多點不同注射途徑,免疫BALB/c小鼠后,取免疫鼠脾細胞與SP2/0細胞融合,篩選分泌抗重組PvALD抗體雜交瘤細胞株,制備抗重組PvALD單抗。 【結果】間日瘧醛縮酶的PCR產(chǎn)物為1.1 kb,經(jīng)酶切、連接、轉化、篩選,獲得相應重組質(zhì)粒,經(jīng)雙酶切和測序鑒定,成功構建了pET32c-PvALD原核表達質(zhì)粒和pPIC9K-PvALD真核表達質(zhì)粒。pET32c-PvALD轉化到BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導表達,所獲包涵體經(jīng)變性、His標簽純化和復性,其重組蛋白的分子量約60 kD。pPIC9K-PvALD重組質(zhì)粒線性化后,轉入GS115畢赤酵母,經(jīng)甲醇誘導可溶性表達,其重組蛋白的分子量為40 kD。兩種重組蛋白交叉免疫小鼠,取脾細胞與SP2/0融合,經(jīng)HAT篩選和ELISA三輪篩選,獲得11株分泌抗重組PvALD單抗的雜交瘤細胞株,培養(yǎng)上清ELISA結果顯示滴度從1:320到1:1,280之間。 【結論】克隆了間日瘧原蟲醛縮酶基因,利用原核表達系統(tǒng)表達并純化了重組PvALD融合蛋白,利用真核表達系統(tǒng)表達并純化了重組PvALD蛋白。制備出11株分泌抗重組PvALD單抗的雜交瘤細胞株。 第三部分泛種特異性抗瘧原蟲單克隆抗體M26-32免疫學特性研究 【目的】改造天然IgM類M26-32單抗為單體IgM亞單位,膠體金標記天然和改造后兩種M26-32用于檢測瘧原蟲抗原。利用M26-32惡性瘧原蟲靶抗原基因篩選間日瘧原蟲cDNA文庫。 【方法】復蘇培養(yǎng)M26-32雜交瘤細胞,接種BALB/c小鼠,收集含有單抗的腹水,用商品HiTrap IgM HP柱純化腹水中的IgM抗體,并用L-半胱氨酸裂解IgM類M26-32單抗成單體IgM亞單位。經(jīng)間接免疫熒光檢定兩種抗體的效價,并用膠體金標記,分別檢測惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲可溶性抗原。利用已知M26-32惡性瘧原蟲靶基因信息,設計引物,擴增紅內(nèi)期間日瘧原蟲SMART cDNA次級文庫,對產(chǎn)物測序鑒定。 【結果】接種20只小鼠,共采集約80 ml單抗腹水,經(jīng)HiTrap IgM HP柱純化,獲得了純度較高的M26-32單抗。經(jīng)L-半胱氨酸裂解后,Native電泳顯示天然IgM被裂解為單體亞單位,IFA結果顯示,亞單位M26-32與天然五聚體IgM滴度無差別。經(jīng)膠體金標記后,兩種金標抗體均分別能檢測1:100稀釋的惡性瘧原蟲和1:10稀釋的間日瘧原蟲可溶性抗原。根據(jù)M26-32單抗針對的惡性瘧原蟲靶抗原基因所設計的9對引物,擴增紅內(nèi)期間日瘧SMART cDNA次級文庫,產(chǎn)物電泳后切膠純化,經(jīng)測序得到的5個序列中,4個屬于載體序列,1個為間日瘧片段,但經(jīng)3個讀碼框架翻譯,均與M26-32已知表位序列不相符。 【結論】建立了L-半胱氨酸裂解IgM類M26-32單抗為單體IgM亞單位及其膠體金標記的方法,為利用M26-32進一步制備相應快速診斷工具打下了基礎。初步篩選了間日瘧原蟲cDNA次級文庫,仍需探索更好的方法以用于篩選M26-32間日瘧原蟲靶抗原基因。 第四部分純化瘧原蟲感染血樣用白細胞濾器的研制及其應用 【目的】開發(fā)一種適用于處理瘧原蟲感染血樣的白細胞濾器,評估其性能和在瘧原蟲相關研究中的應用價值 【方法】設計相應模具并用注塑工藝制備濾器塑料外殼,接枝改性PBT(Polybutylene Terephthalate,聚對苯二甲酸丁二醇酯)熔噴無紡布裁剪后作為濾芯,組合后制備新型瘧原蟲濾器,并對其去除血樣中白細胞的能力進行測試。當新型瘧原蟲濾器達到白細胞去除率99%的要求后,在間日瘧流行區(qū)現(xiàn)場評估其性能,并與經(jīng)典CF11纖維素柱法進行比較,分別測定兩種方法處理間日瘧原蟲感染血樣的白細胞去除率,紅細胞回收率,感染紅細胞密度的變化,并進行體外短期培養(yǎng),觀察瘧原蟲發(fā)育情況。采用瘧原蟲濾器法分別處理惡性瘧原蟲感染者血樣和伯氏瘧原蟲感染鼠血樣,觀察過濾處理前后白細胞和瘧原蟲的變化。【結果】具有3層無紡布濾芯的新型瘧原蟲濾器的白細胞去除率為99.31%, 達到了設計要求,被用于現(xiàn)場評估。15例現(xiàn)場采集間日瘧原蟲感染血樣,分別經(jīng)新型瘧原蟲濾器和CF11柱法處理(樣品血量各相當于全血5 ml),濾器法白細胞去除率為99.03%,優(yōu)于CF11法(98.41%,P0.01),濾器法紅細胞回收率為95.48%,明顯優(yōu)于CF11法(87.05%,P0.01),而兩法處理后瘧原蟲密度無明顯變化(t=0.067,P0.05)。14例體外短期培養(yǎng)結果顯示,濾器法去除白細胞后,瘧原蟲可以正常發(fā)育,與CF11注法相比,兩者原蟲密度、原蟲發(fā)育期別比例及形態(tài),無明顯差別。鏡檢觀察,與過濾前相比,惡性瘧和伯氏瘧原蟲薄血膜涂片感染紅細胞密度沒有明顯下降,原蟲的發(fā)育期別比例和形態(tài)沒有明顯變化,厚血膜涂片中殘留的白細胞大幅減少(1個/10個油鏡視野)。 【結論】成功研制了一種適用于處理瘧原蟲感染血樣的新型瘧原蟲濾器,適合處理間日瘧、惡性瘧原蟲感染者血樣,也適合處理伯氏瘧原蟲感染鼠血樣。經(jīng)現(xiàn)場應用評估,新型瘧原蟲濾器法白細胞去除率和紅細胞回收率均優(yōu)于CF11柱法。濾器法處理后的間日瘧樣本,可以為抗原研究提供更純的研究材料,也適用于體外法短期培養(yǎng)。本法比CF11柱法更加簡便快捷,同時適合實驗室和現(xiàn)場應用。 綜上所述,本課題研究采用新的生物信息學方法,從間日瘧原蟲全基因組蛋白序列中查找重復序列入手,結合連續(xù)B細胞表位預測高通量篩選抗原肽,并對篩到的6個間日瘧原蟲特異性抗原肽進行了驗證;采用分子生物學手段,克隆出了間日瘧原蟲醛縮酶基因,利用原核和真核表達體系分別表達出重組PvALD蛋白,并制備了11株分泌抗重組PvALD單抗的雜交瘤細胞株;應用免疫與分子生物學方法,改造了泛種特異性抗瘧原蟲單抗M26-32為單體IgM亞單位,使之易于標記和檢測,并利用間日瘧原蟲cDNA文庫,對其中潛在的間日瘧原蟲M26-32靶抗原基因進了初步篩選;利用新材料技術,研發(fā)出了適用于瘧原蟲感染血樣處理的新型瘧原蟲濾器,為獲取純化的瘧原蟲抗原研究材料提供了更為高效便捷的工具。
【學位單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2011
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

將反應板放置在酶標儀中，檢測波長：450 nm，參考波長：620 nm，掃描全部反應孔的 OD 值，以陰性對照孔 OD 值的 2.1 倍判斷為陽性。1.4.9 肽-ELISA 檢測間日瘧患者血清中抗合成肽抗體將 20 份間日瘧患者血清從-80°C 冰箱取出，完全融化后，分別用 pH 7.4 PB1:20 稀釋。同時取 20 份健康志愿者血清混合，同樣 PBS 1:20 稀釋。將上述血清作為一抗加入預包被有不同肽的酶標板中。其余反應和檢測操作及結果判斷與 1.4步驟相同，二抗換用 1:5,000 稀釋的 HRP 標記羊抗人 IgG 抗體。2 結果2.1 間日瘧原蟲基因數(shù)據(jù)庫蛋白重復序列多肽的篩選結果（1）通過對 FASTA 格式數(shù)據(jù)進行整理，導入 Access 2003 MDB 數(shù)據(jù)庫后，共有蛋白序列記錄 5,432 個多肽，長度 39~11,429 aa 不等。本數(shù)據(jù)庫包含：基因編號（gID），基因名稱（pName），多肽長度（pLen），多肽序列（pSq）四個主要字段。

圖 1-2 間日瘧原蟲蛋白數(shù)據(jù)庫重復序列查找軟件界面（3）將間日瘧原蟲多肽蛋白數(shù)據(jù)庫導入 MS SQL 后，啟動軟件進行 1列全庫比對，經(jīng)過連續(xù)運行程序 2 周（約 130 h）后，全部序列比對完成了約 320 萬行比對數(shù)據(jù)（圖 1-3）。利用 SQL 查詢語句篩選出重復程度最0 個 16 肽序列，重復程序從 18 次~3 次不等。

圖 1-2 間日瘧原蟲蛋白數(shù)據(jù)庫重復序列查找軟件界面（3）將間日瘧原蟲多肽蛋白數(shù)據(jù)庫導入 MS SQL 后，啟動軟件進行 16 肽序列全庫比對，經(jīng)過連續(xù)運行程序 2 周（約 130 h）后，全部序列比對完成，生了約 320 萬行比對數(shù)據(jù)（圖 1-3）。利用 SQL 查詢語句篩選出重復程度最高000 個 16 肽序列，重復程序從 18 次~3 次不等。
【引證文獻】

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1 劉婷;家蠶微孢子蟲單克隆抗體G9靶蛋白的鑒定[D];西南大學;2013年

本文編號：2839459