背景:樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)是目前公認(rèn)的抗原提呈功能最強(qiáng)的細(xì)胞。結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合體1(tuberous sclerosis complex 1,Tsc1)是哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)的上游關(guān)鍵性抑制因子,對細(xì)胞生長發(fā)育起著重要的調(diào)控作用。我們課題組前期研究表明,Tsc1在DC發(fā)育和激活中具有重要作用,并且Tsc1可通過抑制mTORC1促進(jìn)T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和應(yīng)答;然而,Tsc1在轉(zhuǎn)錄水平對DC穩(wěn)態(tài)和抗原提呈功能相關(guān)基因的調(diào)控的分子機(jī)制仍未闡明。目的:本研究通過比較特異性敲除Tsc1基因的小鼠DC與CD11c-Cre重組酶陰性對照的小鼠DC的轉(zhuǎn)錄譜,探究Tsc1在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控DC穩(wěn)態(tài)和抗原提呈功能的分子機(jī)制。方法:(1)利用Cre-LoxP重組酶系統(tǒng),通過將體內(nèi)Tsc1兩端均帶有l(wèi)oxP序列的Tsc1~(f/f)轉(zhuǎn)基因小鼠和在溶菌酶啟動(dòng)子調(diào)控下表達(dá)CD11c-cre重組酶的CD11c~(Cre)轉(zhuǎn)基因小鼠(即親代小鼠)雜交,建立CD11c-Cre重組酶陰性即未敲除DC中Tsc1且體內(nèi)Tsc1兩端均帶有LoxP序列的純合子對照組小鼠(Tsc1~(f/f)小鼠)和CD11c-Cre重組酶陽性即敲除DC中Tsc1且體內(nèi)Tsc1兩端均帶有LoxP序列的純合子小鼠(CD11c~(Cre)Tsc1~(f/f)小鼠),然后采用PCR和Western blot分別在基因水平與蛋白水平鑒定小鼠DC中Tsc1敲除情況;(2)Tsc1~(f/f)小鼠和CD11c~(Cre)Tsc1~(f/f)小鼠脾臟細(xì)胞先后經(jīng)CD11c磁珠分選及流式分選儀分選后獲得高純度DC;(3)設(shè)立3組實(shí)驗(yàn)組,即Tsc1~(f/f)對照組、CD11c~(Cre)Tsc1~(f/f)組和體外將CD11c~(Cre)Tsc1~(f/f)小鼠脾臟DC經(jīng)雷帕霉素(rapamycin,RAPA)處理組(RAPA是mTORC1特異性抑制劑,經(jīng)RAPA處理以抑制mTORC1后觀察mTORC1改變對Tsc1對DC調(diào)控的影響);(4)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組DC線粒體膜電位和膜通道孔活性、凋亡率、Ki67增殖抗原表達(dá)水平以及通過Eα多肽刺激后MHC II類復(fù)合物表達(dá)水平測定DC抗原提呈能力;(5)采用基因芯片檢測3組實(shí)驗(yàn)組DC的全轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá),分析差異基因,經(jīng)京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)和基因集富集分析(gene-set enrichment analysis,GSEA)探究DC中信號通路富集分析;(6)經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)驗(yàn)證差異基因的表達(dá)水平。結(jié)果:(1)成功建立了特異性敲除DC中Tsc1的基因敲除小鼠(CD11c~(Cre)Tsc1~(f/f)小鼠),并且在基因水平以及蛋白水平驗(yàn)證DC中Tsc1被特異性敲除。(2)相對于Tsc1~(f/f)對照組,CD11c~(Cre)Tsc1~(f/f)組DC的凋亡率、線粒體膜電位和通透性和Ki67增殖抗原表達(dá)水平均明顯增加;經(jīng)RAPA處理后,DC的凋亡率和增殖抗原Ki67表達(dá)水平均降低。而且Eα多肽刺激后,CD11c~(Cre)Tsc1~(f/f)組DC的MHC II類復(fù)合物表達(dá)水平,即DC抗原提呈能力明顯強(qiáng)于Tsc1~(f/f)對照組DC,并且可被RAPA所抑制。(3)KEGG和GSEA分析顯示DC中的Tsc1對許多調(diào)控代謝的基因表達(dá)具有顯著影響,這些代謝過程包括糖酵解、氧化磷酸化、脂肪酸代謝、蛋白質(zhì)代謝、氨基酸代謝、tRNA轉(zhuǎn)運(yùn)、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、吞噬作用和內(nèi)吞作用等。(4)基因芯片檢測結(jié)果顯示,相對于Tsc1~(f/f)小鼠,CD11c~(Cre)Tsc1~(f/f)組小鼠DC在調(diào)控DC存活、增殖、代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)以及抗原提呈等方面的相關(guān)基因表達(dá)水平均增加,這些基因包括Bub1b、Mad2l1、Ccnb2、Ccnb1、Casp6、Casp8、Prkaca、Cox6a2、Hk3、Ndufs8、Tpi1、Man1c1、Hpse、Nfe2l2、Renbp、Hexa、Lpin1、Acot2、Hexb、Xbp1、Nup35、Aaas、Sec61g、Nrp1、Lgmn、Cd4、Ctsb與Ctsl等;而且,CD11c~(Cre)Tsc1~(f/f)小鼠脾臟DC體外經(jīng)RAPA作用、抑制mTORC1后,上述基因的改變幅度明顯減弱;RT-qPCR確認(rèn)了基因芯片的檢測結(jié)果。結(jié)論:Tsc1可以從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控與DC存活、增殖、代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)以及抗原提呈相關(guān)的基因表達(dá),從而影響DC的穩(wěn)態(tài)和抗原提呈功能;而且上述效應(yīng)受mTORC1活性的影響。
【學(xué)位單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

sc1 在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控 DC 穩(wěn)態(tài)和抗原提呈功能的1cCre小鼠和 Tsc1f/f小鼠雜交分別建立出特異性CD11cCreTsc1f/f）和 CD11c-Cre 重組酶陰性對照f/f小鼠和 Tsc1f/f小鼠基因型鑒定C 的分離以及純化有重要的免疫學(xué)功能，所以獲得相當(dāng)數(shù)量的高則十分重要。然而，我們通過小鼠 DC 流式表細(xì)胞中 DC 的比例很低，僅占 1.45%（見圖 1嚴(yán)重影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果；因此，我們首先通過1c+細(xì)胞；然后，再將經(jīng) CD11c+磁珠陽選后的細(xì)、MHCⅡ，通過流式分選儀獲得 CD11c+MHC。通過流式檢測，經(jīng)過兩次富集，CD11c+MH

- 27 -圖 3. Tsc1 對 DC 全轉(zhuǎn)錄組的影響（A）火山圖顯示 CD11cCreTsc1f/f小鼠和對照組 Tsc1f/f小鼠 DC 中 mRNA 表達(dá)水平差異的基因（fold change> 2，P <0.05）；（B）通過 GSEA 分析 CD11cCreTsc1f/f小鼠和 Tsc1f/f小鼠 DC中信號通路富集（P <0.05）。3. Tsc1 對 DC 穩(wěn)態(tài)的調(diào)控3.1 Tsc1 敲除可促進(jìn) DC 增殖，該過程受 mTORC1 影響

Ki67 是一種增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原,其功能與有絲分裂密切相關(guān)，其表的增殖密切相關(guān)，表達(dá)水平越高說明細(xì)胞增殖越活躍[26]。我們采用流檢測 DC 胞內(nèi)增殖抗原 Ki67，如圖 4 所示，CD11cCreTsc1f/f小鼠 DC 高于 Tsc1f/f對照組小鼠 DC。而且，經(jīng) RAPA 作用后，CD11cCreTsc1f增殖能力減弱。這些結(jié)果表明，特異性敲除 DC 中 Tsc1 促進(jìn) DC 的增受到 mTORC1 活性影響。
【參考文獻(xiàn)】

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1 王祖秀;郝彥哲;侯萬儒;;大熊貓NADH-輔酶Q氧化還原酶鐵硫蛋白亞基6基因(NDUFS6)的序列分析[J];獸類學(xué)報(bào);2008年03期

2 ;The Phenotypic Characterization of Naturally Occurring Regulatory CD4~+CD25~+T Cells[J];Cellular & Molecular Immunology;2006年03期

本文編號：2839379