本文關(guān)鍵詞：密度感應(yīng)系統(tǒng)對弗氏志賀菌生長競爭能力的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：志賀氏菌是細(xì)菌性痢疾的主要病原體,一般感染10-100個志賀式菌就能使人發(fā)病,全世界每年的感染人數(shù)可達(dá)到1.6億,其中發(fā)展中國家的死亡病例高達(dá)90%以上。志賀氏菌傳播的主要途徑是糞口,其可以入侵炎癥上皮細(xì)胞,導(dǎo)致膿腫和潰瘍等強烈的炎癥反應(yīng)。近年來,微生物群體間的相互作用越來越引起人們的關(guān)注,細(xì)菌所表現(xiàn)出的細(xì)胞相互作用,如抗生素的產(chǎn)生、菌體自身的發(fā)育及孢子的形成等,都需要高密度細(xì)胞共同協(xié)作完成。而密度感應(yīng)系統(tǒng)是細(xì)菌間重要的交流系統(tǒng),可通過細(xì)菌密度來調(diào)控這些協(xié)作行為。據(jù)研究顯示,在基因組水平上,大腸桿菌和志賀氏菌存在同源性和相似性,但兩者在表型及致病性方面表現(xiàn)出較大的差異。通過對比兩種菌的基因序列發(fā)現(xiàn):在兩者的基因序列中,都含有密度感應(yīng)系統(tǒng)操縱子基因,但兩者存在一定差異。與大腸桿菌體內(nèi)的密度感應(yīng)系統(tǒng)相比,志賀氏菌體內(nèi)缺少了密度感應(yīng)系統(tǒng)的某些基因,如lsr K,lsr B,lsr F。本研究利用傳統(tǒng)的酶切連接法構(gòu)建了密度感應(yīng)系統(tǒng)缺失基因回復(fù)株301/p Pro-lsr BFK,利用Golden Gate克隆法構(gòu)建了完整密度感應(yīng)系統(tǒng)回復(fù)株301/p ET28a-lsr KG。測定了弗氏2a志賀菌301野生株,301/p Pro-lsr BFK,301/p ET28a-lsr KG的生長曲線,比較它們在生長方面的差異;將兩種不同細(xì)菌混合培養(yǎng),通過菌落計數(shù),分析判斷缺失基因回復(fù)后對細(xì)菌生長優(yōu)勢的影響;制備野生株301、301/p Pro-lsr BFK與301/p ET28a-lsr KG的蛋白樣品,進行雙向凝膠電泳,比較野生株301、301/p Pro-lsr BFK與301/p ET28a-lsr KG的蛋白圖譜并尋找差異蛋白點,經(jīng)質(zhì)譜鑒定得到差異蛋白點的信息,分析差異蛋白的可能作用。有關(guān)實驗的詳細(xì)結(jié)果,綜合如下:1.利用酶切連接法和Golden Gate克隆法成功構(gòu)建了密度感應(yīng)系統(tǒng)缺失基因回復(fù)株301/p Pro-lsr BFK和完整密度感應(yīng)系統(tǒng)回復(fù)株301/p ET28a-lsr KG。2.利用哈氏弧菌BB170對信號分子AI-2生物發(fā)光的特性,檢測弗氏2a志賀菌301可以向胞外釋放并分泌有活性的信號分子AI-2,并使哈氏弧菌BB170產(chǎn)生熒光。3.301/p Pro-lsr BFK、301/p ET28a-lsr KG與野生株301相比,在生長曲線上沒有較大差別,但301/p Pro-lsr BFK、301/p ET28a-lsr KG菌株在穩(wěn)定期達(dá)到的細(xì)菌密度更大。4.對301/p Pro-lsr BFK,301/p ET28a-lsr KG,野生株301,MG1655進行混合培養(yǎng),通過菌落計數(shù)計算其生長比例,其結(jié)果表明:缺失基因回復(fù)株301/p Pro-lsr BFK與野生株301相比,不具有生長優(yōu)勢;而完整基因簇回復(fù)株301/p ET28a-lsr KG與野生株301相比,具有較明顯的生長優(yōu)勢。.利用雙向凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù),對比301/pPro-lsr BFK,5.利用雙向凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù),對比301/p Pro-lsr BFK,301/p ET28a-lsr KG和野生株301的全菌蛋白雙向凝膠電泳圖譜,運用比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析差異蛋白點。結(jié)果表明:缺失基因回復(fù)株301/p Pro-lsr BFK相對于野生株301來說,蛋白差異點不明顯;完整基因回復(fù)株301/p ET28a-lsr KG相對于野生株301的蛋白圖譜分析,兩者存在多個蛋白差異點。其中比較重要的蛋白差異點有:密度感應(yīng)系統(tǒng)中信號分子的轉(zhuǎn)運蛋白Lsr B蛋白;與蛋白折疊相關(guān)的分子伴侶蛋白Gro EL;與代謝相關(guān)的酶類,如icd A編碼的異檸檬酸脫氫酶、sdh A編碼的琥珀酸脫氫酶,以及與電子傳遞鏈相關(guān)的氧化還原酶,如fab I編碼的NADH還原型輔酶、nuo I編碼的NADH脫氫酶等。
【關(guān)鍵詞】：弗氏志賀菌 密度感應(yīng)系統(tǒng) 信號分子AI-2 生長優(yōu)勢 比較蛋白質(zhì)組學(xué)
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R378.25
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 引言11-18
• 1.1 志賀氏菌的簡介11
• 1.2 志賀氏菌致病的毒力基因11-12
• 1.2.1 由毒力大質(zhì)粒編碼的侵襲區(qū)毒力蛋白11
• 1.2.2 由毒力大質(zhì)粒侵襲區(qū)外部基因編碼的毒力蛋白11-12
• 1.2.3 染色體上編碼的相關(guān)毒力蛋白12
• 1.3 密度感應(yīng)系統(tǒng)的簡介12
• 1.4 密度感應(yīng)系統(tǒng)信號分子在細(xì)菌中的類型12-15
• 1.4.1 I類信號系統(tǒng)12-13
• 1.4.2 II型信號分子系統(tǒng)13-14
• 1.4.3 III型誘導(dǎo)子系統(tǒng)14-15
• 1.5 密度感應(yīng)系統(tǒng)信號分子的化學(xué)組成分類15-17
• 1.5.1 革蘭氏陰性菌中AHL的類型15-16
• 1.5.2 革蘭氏陽性菌中的短肽（AIP）信號分子16-17
• 1.6 本研究的目的和意義17-18
• 第二章 弗氏 2a志賀菌密度感應(yīng)系統(tǒng)缺失基因回復(fù)株的構(gòu)建及其功能研究18-38
• 2.1 研究背景18-19
• 2.2 材料19-21
• 2.2.1 質(zhì)粒與菌株19
• 2.2.2 實驗所用儀器和主要試劑19
• 2.2.2.1 實驗中所用到的主要儀器19
• 2.2.2.2 實驗中所用到的主要試劑19
• 2.2.3 培養(yǎng)基的配制及所用抗生素的濃度19-20
• 2.2.4 雙向凝膠電泳所用試劑的配制20-21
• 2.2.5 膠內(nèi)酶切相關(guān)溶液的配制21
• 2.3 方法21-29
• 2.3.1 弗氏 2a志賀菌301密度感應(yīng)系統(tǒng)缺失基因回復(fù)株的構(gòu)建21-24
• 2.3.1.1 引物設(shè)計、合成及DNA的測序21-22
• 2.3.1.2 密度感應(yīng)系統(tǒng)缺失基因回復(fù)株 301/pPro-lsrBFK的構(gòu)建22-24
• 2.3.1.3 重組質(zhì)粒pPro-lsrBFK電擊轉(zhuǎn)化301感受態(tài)24
• 2.3.1.4 陽性克隆的篩選24
• 2.3.2 密度感應(yīng)系統(tǒng)缺失回復(fù)株在分子水平上的驗證24
• 2.3.3 密度感應(yīng)系統(tǒng)缺失回復(fù)株與野生株 301，MG1655 生長狀態(tài)的測定24-25
• 2.3.4 密度感應(yīng)系統(tǒng)信號分子AI-2 的檢測25
• 2.3.5 密度感應(yīng)系統(tǒng)缺失回復(fù)株與野生株 301，MG1655 生長優(yōu)勢的比較25-26
• 2.3.6 缺失基因回復(fù)株 301/pPro-lsrBFK與野生株301比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析26-28
• 2.3.6.1 樣品的制備26-27
• 2.3.6.2 雙向凝膠電泳27-28
• 2.3.7 脫色及掃膠28-29
• 2.4 結(jié)果與分析29-36
• 2.4.1 密度感應(yīng)系統(tǒng)缺失回復(fù)株的構(gòu)建與驗證29-30
• 2.4.2 回復(fù)株 301/pPro-lsrBFK與野生株 301，MG1655 生長狀態(tài)的測定30-31
• 2.4.3 密度感應(yīng)系統(tǒng)信號分子AI-2 的檢測31-33
• 2.4.4 密度感應(yīng)系統(tǒng)缺失回復(fù)株 301/pPro-lsrBFK與野生株 301，MG1655 生長優(yōu)勢的比較33-36
• 2.4.4.1 缺失回復(fù)株 301/pPro-lsrBFK與301野生株的生長優(yōu)勢33-34
• 2.4.4.2 缺失回復(fù)株 301/pPro-lsrBFK與MG1655 菌株的生長優(yōu)勢34-36
• 2.4.5 缺失回復(fù)株 301/pPro-lsrBFK與弗氏這賀菌301野生株雙向電泳圖譜比較 . 2936
• 2.5 討論36-38
• 第三章 弗氏 2a志賀菌密度感應(yīng)系統(tǒng)完整基因回復(fù)株的構(gòu)建及其功能研究38-61
• 3.1 研究背景38
• 3.2 材料38-40
• 3.2.1 質(zhì)粒與菌株38-39
• 3.2.2 實驗所用儀器和主要試劑39
• 3.2.2.1 實驗中所用到的主要儀器39
• 3.2.2.2 實驗中所用到的主要試劑39
• 3.2.3 培養(yǎng)基的配制及所用抗生素的濃度39-40
• 3.3 方法40-45
• 3.3.1 弗氏 2a志賀菌301密度感應(yīng)系統(tǒng)完整基因回復(fù)株的構(gòu)建40-43
• 3.3.1.1 引物設(shè)計、合成及DNA的測序40
• 3.3.1.2 密度感應(yīng)系統(tǒng)完整基因回復(fù)株 301/pET28a-lsrKG的構(gòu)建40-43
• 3.3.1.3 重組質(zhì)粒pET28a-lsrKG電擊轉(zhuǎn)化301感受態(tài)43
• 3.3.1.4 陽性克隆的篩選43
• 3.3.2 密度感應(yīng)系統(tǒng)完整基因回復(fù)株在分子水平上的驗證43
• 3.3.3 密度感應(yīng)系統(tǒng)缺失回復(fù)株 301/ pET28a-lsrKG與野生株 301，MG1655 生長狀態(tài)的測定43-44
• 3.3.4 完整基因回復(fù)株 301/ pET28a-lsrKG與野生株 301，MG1655 生長優(yōu)勢的比較44
• 3.3.5 完整基因回復(fù)株 301/ pET28a-lsrKG與野生株301比較蛋白質(zhì)組學(xué)比較44-45
• 3.3.5.1 樣品的制備44
• 3.3.5.2 雙向凝膠電泳44
• 3.3.5.3 脫色及掃膠44
• 3.3.5.4 膠內(nèi)酶切44-45
• 3.3.5.5 胰酶酶解肽段的質(zhì)譜檢測45
• 3.3.5.6 質(zhì)譜檢測結(jié)果的數(shù)據(jù)庫查詢45
• 3.3.5.7 蛋白質(zhì)表達(dá)情況分析45
• 3.4 結(jié)果與分析45-56
• 3.4.1 完整基因回復(fù)株 301/ pET28a-lsrKG的構(gòu)建與驗證45-47
• 3.4.2 完整基因回復(fù)株 301/ pET28a-lsrKG與野生株 301，MG1655 生長狀態(tài)的測定47-48
• 3.4.3 完整基因回復(fù)株 301/ pET28a-lsrKG與野生株 301，MG1655 生長優(yōu)勢的比較48-54
• 3.4.3.1 完整基因回復(fù)株 301/ pET28a-lsrKG與301野生株的生長優(yōu)勢48-51
• 3.4.3.2 301/pET28a-lsrKG與MG1655 的生長優(yōu)勢實驗結(jié)果51-54
• 3.4.4 完整基因回復(fù)株 301/pET28a-lsrK-G與野生株301比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究54-56
• 3.4.4.1 雙向凝膠電泳圖譜54
• 3.4.4.2 差異表達(dá)蛋白的質(zhì)譜鑒定結(jié)果54-56
• 3.5 討論56-61
• 第四章 結(jié)論與展望61-63
• 4.1 結(jié)論61-62
• 4.1.1 構(gòu)建了密度感應(yīng)系統(tǒng)缺失基因回復(fù)株 301/pPro-lsrBFK和密度感應(yīng)系統(tǒng)完整基因回復(fù)株 301/pET28a-lsrKG，并對其生長狀態(tài)進行檢測61
• 4.1.2 檢測了弗氏 2a志賀菌301密度感應(yīng)系統(tǒng)信號分子AI-2 的存在61
• 4.1.3 檢測了密度感應(yīng)系統(tǒng)缺失基因回復(fù)株 301/pPro-lsrBFK和密度感應(yīng)系統(tǒng)完整基因回復(fù)株 301/pET28a-lsrKG，，與野生株 301，MG1655 的生長優(yōu)勢61-62
• 4.1.4 構(gòu)建菌株的雙向電泳圖譜62
• 4.2 展望62-63
• 致謝63-64
• 參考文獻64-70
• 附錄1 作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文70-71
• 附錄2 實驗中所用儀器設(shè)備71-72
• 附錄3 實驗中所用試劑72-74
• 附錄4 各種試劑盒使用步驟74-77

【共引文獻】

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4 劉偉;崔艷華;曲曉軍;;乳酸菌雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)研究進展[J];生物技術(shù)通報;2011年05期

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  本文關(guān)鍵詞：密度感應(yīng)系統(tǒng)對弗氏志賀菌生長競爭能力的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：283793