第一部分脂肪干細(xì)胞的分離、純化及培養(yǎng)目的:建立一種分離、純化及培養(yǎng)SD大鼠脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)簡(jiǎn)便有效的方法,為組織工程學(xué)提供理想的種子細(xì)胞。方法:1、選健康成年SD雄性大鼠,大鼠腹部和腹股溝處剪取皮下脂肪,采用酶消化法分離出脂肪干細(xì)胞,通過(guò)體外培養(yǎng)及連續(xù)傳代方法,純化、擴(kuò)增脂肪干細(xì)胞。2、倒置相差顯微鏡觀察ADSCs的形態(tài)學(xué)變化,用免疫熒光法檢測(cè)表面抗原CD44表達(dá)情況。3、分離培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞行成軟骨、成骨誘導(dǎo)分化,特定試劑進(jìn)行細(xì)胞染色,確定脂肪干細(xì)胞的分化潛能。結(jié)果:1、取材4h后可見細(xì)胞貼壁,散在分布,48 h后貼壁細(xì)胞有觸角伸出,體積增大,呈纖維細(xì)胞樣的短梭形,顆粒逐漸增多,五六天后細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng),細(xì)胞變?yōu)殚L(zhǎng)梭形,旋渦狀排列,傳代后,細(xì)胞形態(tài)均一,克隆形成。2、熒光顯微鏡下觀察到紅色熒光,DAPI復(fù)染核呈藍(lán)色,ADSCs細(xì)胞表面抗原CD44呈陽(yáng)性表達(dá)。3、脂肪干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)后分化形成質(zhì)地致密的細(xì)胞團(tuán),然后使用阿利新藍(lán)染色,鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)大量藍(lán)色基質(zhì)顆粒;成骨誘導(dǎo)后分化使用茜素紅染色可見大量橘紅色的鈣結(jié)節(jié)。結(jié)論:酶消化法分離、貼壁純化傳代出的脂肪干細(xì)胞,生長(zhǎng)狀態(tài)良好、增殖速度快、純度高,是一種簡(jiǎn)便而有效的分選培養(yǎng)方法,可得到理想的種子細(xì)胞,為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供可靠的、穩(wěn)定的細(xì)胞來(lái)源。第二部分Wnt通路和Sox9相互反饋調(diào)節(jié)脂肪干細(xì)胞成軟骨分化中的作用目的:研究Wnt通路對(duì)脂肪干細(xì)胞成軟骨分化能力的影響,觀察Sox9在脂肪干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化過(guò)程中的表達(dá),重點(diǎn)研究?jī)烧呦嗷ブg的關(guān)聯(lián),探討Wnt通路調(diào)控脂肪干細(xì)胞成軟骨分化的作用機(jī)制。如果能夠?qū)⑵鋺?yīng)用于臨床,相信能夠?yàn)楣顷P(guān)節(jié)中關(guān)節(jié)軟骨組織缺損后修復(fù)、再生,提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),對(duì)ADSCs在促進(jìn)骨關(guān)節(jié)康復(fù)治療領(lǐng)域的進(jìn)一步廣泛應(yīng)用意義重大。方法:1、激動(dòng)劑LiCL刺激干預(yù)脂肪干細(xì)胞后,CCK-8法觀察ADSCs增殖活性及Western blot檢測(cè)PCNA蛋白的表達(dá)情況。2、脂肪干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化各時(shí)期,對(duì)軟骨指標(biāo)Sox9、Aggrecan、Collagen2a及Wnt通路關(guān)鍵分子β-catenin進(jìn)行Western blot、RT-q PCR層面的檢測(cè),用以評(píng)估其向軟骨分化的能力。3、激動(dòng)劑LiCL、抑制劑Dkk-1刺激干預(yù)脂肪干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化,重點(diǎn)檢測(cè)干預(yù)后第7天(早期)、第21天(晚期),軟骨指標(biāo)Sox9、Aggrecan、Collagen2a及Wnt通路關(guān)鍵分子β-catenin的蛋白及m RNA的表達(dá)情況。4、脂肪干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化第21-35天(后期),RT-q PCR檢測(cè)成熟軟骨Collagen2a、Collagen10及早期成骨分化指標(biāo)RUNX2的m RNA水平,Western blot檢測(cè)Sox9、β-catenin蛋白的表達(dá)情況。5、激動(dòng)劑LiCL、抑制劑Dkk-1刺激干預(yù)脂肪干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化第28天(后期),Western blot檢測(cè)Sox9、β-catenin蛋白水平及Collagen2a、RUNX2蛋白分化指標(biāo)。6、采用慢病毒作為載體,將Sox9基因轉(zhuǎn)染進(jìn)脂肪干細(xì)胞,使其得到穩(wěn)定表達(dá),RT-q PCR檢測(cè)成軟骨誘導(dǎo)分化過(guò)程中特異性標(biāo)志物Collagen2a、Aggrecan表達(dá)水平,定量測(cè)定分泌型糖胺多糖(glycosaminoglycanes GAG)的含量。同時(shí),對(duì)Sox9、β-catenin進(jìn)行Western blot蛋白層面的檢測(cè),用以評(píng)估其向軟骨分化的能力。7、Sox9慢病毒載體陽(yáng)性轉(zhuǎn)染脂肪干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化第21天,免疫熒光檢測(cè)Collagen2a的表達(dá),Western blot檢測(cè)Wnt通路相關(guān)蛋白β-catenin、GSK-3β、p-β-catenin蛋白的表達(dá)情況;結(jié)果:1、激動(dòng)劑LiCL刺激脂肪干細(xì)胞后,ADSCs增殖能力增強(qiáng),且PCNA蛋白呈現(xiàn)高表達(dá)。2、軟骨指標(biāo)Sox9、Aggrecan、Collagen2a的逆轉(zhuǎn)錄基因及蛋白表達(dá)隨著時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)增多態(tài)勢(shì);GAG的含量也呈現(xiàn)增多態(tài)勢(shì),且在第14天增加顯著。而Wnt通路關(guān)鍵分子β-catenin蛋白則先減少后增加。3、成軟骨誘導(dǎo)分化第7天(早期)、第21天(晚期),LiCL促進(jìn)Sox9、Aggrecan、Collagen2a、β-catenin蛋白表達(dá),Dkk-1抑制各軟骨指標(biāo)表達(dá);4、成軟骨誘導(dǎo)分化第21-35天(后期),隨著時(shí)間的推移,Collagen2a表達(dá)逐漸減少;RUNX2、Collagen10的m RNA表達(dá)逐漸增多,β-catenin蛋白表達(dá)逐漸增多,Sox9蛋白表達(dá)則逐漸減少。LiCl促進(jìn)β-catenin蛋白表達(dá),同時(shí)下調(diào)Sox9、Collagen2a蛋白的表達(dá),DKK-1組結(jié)果則相反。5、Sox9慢病毒載體陽(yáng)性轉(zhuǎn)染脂肪干細(xì)胞后,設(shè)置為轉(zhuǎn)染組,其Collagen2a、Aggrecan m RNA水平明顯高表達(dá),GAG的含量測(cè)定也明顯高表達(dá);Western blot檢測(cè),Sox9慢病毒轉(zhuǎn)染組顯著低表達(dá)。6、成軟骨誘導(dǎo)分化第21天(晚期),免疫熒光檢測(cè)顯示Sox9慢病毒轉(zhuǎn)染組Collagen2a明顯高表達(dá);Western blot檢測(cè)GSK-3β、p-β-catenin蛋白水平增高。結(jié)論:1、LiCL能激活Wnt通路關(guān)鍵蛋白β-catenin,在成軟骨誘導(dǎo)分化中促進(jìn)脂肪干細(xì)胞快速增殖。2、LiCL能激活Wnt通路關(guān)鍵蛋白β-catenin,在早期調(diào)控Sox9促進(jìn)成軟骨誘導(dǎo)分化,快速增殖;晚期繼續(xù)調(diào)控Sox9促進(jìn)成軟骨誘導(dǎo)分化,后期慢慢下調(diào)Sox9,減弱成熟軟骨表型表達(dá),使軟骨變得肥大、早期成骨增生。Dkk-1刺激可抑制Wnt通路,起相反作用。3、Sox9過(guò)表達(dá)可反饋抑制β-catenin蛋白的表達(dá),促使其降解,維持成軟骨誘導(dǎo)的分化。
【學(xué)位單位】：廣西中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

（2）48 小時(shí)后，脂肪貼壁細(xì)胞牢固粘附，生長(zhǎng)良好，顆粒明顯增多，細(xì)胞體積較前明顯增大，遮光性弱，局部呈現(xiàn)出克隆樣集落生長(zhǎng)；（3）6 天后，貼壁細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)大致呈現(xiàn)一樣，細(xì)胞體變得狹長(zhǎng)，呈梭行或漩渦狀排列�？梢姍E圓形的細(xì)胞核，偶見雙核出現(xiàn)；（圖 1）1-11-21-3

圖 1-1、4 小時(shí)后脂肪干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察圖 1-2、48 小時(shí)候脂肪干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察圖 1-3、6 天后脂肪干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察二、SD 大鼠脂肪干細(xì)胞表面抗原 CD44 的免疫熒光檢測(cè)免疫熒光法檢測(cè)傳代的脂肪干細(xì)胞，結(jié)果顯示細(xì)胞表面抗原CD44 呈陽(yáng)性表達(dá)。（圖 2）圖 1 脂肪干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察2-1 2-22-3

圖 3-1、脂肪干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化后，阿利新藍(lán)染色圖 3-2、脂肪干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化后，茜素紅染色討論脂肪組織主要成分是脂肪細(xì)胞，約占 50%-70%，還有脂肪干細(xì)胞、脂肪祖細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、造血干細(xì)胞、免疫細(xì)胞等[13-16]。 脂肪干細(xì)胞（ADSCs）是由中胚層發(fā)育而來(lái)的多向分化潛能干細(xì)胞。2001 年，Zuk 等最早從抽吸的脂肪組織中分離得到。Zuk 等[17]在研究中發(fā)現(xiàn)，脂肪干細(xì)胞接種后 4 h 可見細(xì)胞貼壁，圖 3 脂肪干細(xì)胞二系分化
【參考文獻(xiàn)】

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